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流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

1.試劑盒簡(jiǎn)介貨

流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒主要感染當(dāng)年草魚種和青魚線上線下，死亡率可達(dá)80%以上發揮重要作用。其它淡水鯉科魚，如鰱魚數據顯示、鳙魚高質量、鯽魚、鯉魚感染后沒(méi)有臨床癥狀記得牢，但可以攜帶病毒到處傳播註入了新的力量。該病在水溫高于20℃以上時(shí)流行, 25～28℃為流行高峰。常見的臨床癥狀為眼突出更多可能性、體色發(fā)黑去創新，口腔、鰓蓋和鰭條基部出血緊迫性。撕開表皮結構，可見肌肉出現(xiàn)點(diǎn)狀或塊狀出血。剖檢腹腔, 可見腸道充血, 肝高效、脾充血或因失血而發(fā)白溝通協調。病原為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員體系。病毒為直徑70nm的球形顆粒保障性，有雙層衣殼，無(wú)囊膜責任製，含有11個(gè)片段的雙鏈RNA十分落實。根據(jù)片段長(zhǎng)度大小分為大（L1、L2促進善治、L3擴大，大小在4.0kb～3.7kb）、中（M4、M5新格局、M6明顯，大小在2.5～2.0kb）、酗@示。⊿7創新為先、S8、S9集聚、S10競爭力、S11, 大小在1.6～1.0kb) 三組。在不同地區(qū)存在抗原性狀況、核酸電泳圖譜機製性梗阻、對(duì)細(xì)胞的敏感性和對(duì)魚的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經(jīng)確定的有二個(gè)典型的代表株：GCRV-873為湖南株全過程，能在CO集成應用、CIK等細(xì)胞中大量增殖并出現(xiàn)CPE，癥狀以內(nèi)臟出血為主不負眾望；GCRV-9014為湖北株高效流通，能在CIK、CO細(xì)胞中大量增殖精準調控，但不產(chǎn)生CPE功能，癥狀以肌肉出血為主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%解決。為了適應(yīng)草魚出血差A期。℅CRV）快速檢測(cè)和疫病研究的需要，本公司嚴(yán)格依據(jù)SN/T3584-2013草血病檢疫技術(shù)規(guī)范規(guī)定的檢測(cè)GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)集成技術，在本公司嚴(yán)謹(jǐn)?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下生產(chǎn)和質(zhì)檢就能壓製。確保本試劑盒滿足標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求。本試劑盒具有快速靈敏適應能力、特異、準(zhǔn)確各方面、安全防控、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)適應性。

2堅實基礎、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴(kuò)增試劑。具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

*： 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應(yīng)液

酶混合物陰性對(duì)照

GCRV-9014 陽(yáng)性對(duì)照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

（注：*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）

3重要作用、樣本采集,存放及運(yùn)輸

3.1流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干等地。

取新鮮魚類組織臟器（肝、腦、脾規定、腎）2g 于已洗凈環境、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS 混勻責任，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中備用應用情況。或取有可疑細(xì)胞病變的細(xì)胞懸液用于檢測(cè)組建。

3.2存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h表現；-70 ℃以下可*保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融 3 次）深刻變革。

3.3運(yùn)輸：采用冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸結論。

4、一步法 RT-PCR 檢測(cè)

4.1操作方法

4.1.1樣本的處理（在樣本制備區(qū)進(jìn)行）：

4.1.1.1取 n 個(gè)滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管質生產力，其中 n 為被檢樣品與陰性對(duì)照的和（陽(yáng)性對(duì)照適應性強、陰性對(duì)照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記處理。(注：試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照直接作為 PCR 檢測(cè)的模板建設，無(wú)需提取核酸)

4.1.1.2每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對(duì)照各 200 ?L助力各行，一份樣本換用一個(gè)吸頭前來體驗，再加入 200 ?L 氯仿，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過(guò)于強(qiáng)烈確定性，以免產(chǎn)生乳化層更加廣闊，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min講故事。

4.1.1.3取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管非常完善，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預(yù)冷）， 做標(biāo)記全面革新。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中作用，上清液應(yīng)至少吸取 500?L，不能吸出中間層行業分類，顛倒混勻技術特點。

4.1.1.4于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）發展邏輯，小心倒去上清凝聚力量，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)聽得進；加入 600 ?L 75％ 乙醇範圍和領域，顛倒洗滌有所增加。

4.1.1.5于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）更高要求，小心倒去上清越來越重要的位置，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）學習。

4.1.1.64 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）結構重塑，將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清應用優勢，用微量加樣器將其吸干高質量發展，一份樣本換用一個(gè)吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面高效節能，室溫干燥 3 min影響力範圍，不能過(guò)于干燥，以免 RNA 不溶新創新即將到來。

4.1.1.7加入 11 ?L DEPC 水邁出了重要的一步，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA設施，2 000 r/min 離心 5 s需求，冰上保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉?RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增組合運用；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)更讓我明白了。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說(shuō)明書》（貨號(hào)：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取核酸】積極。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增探索；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

4.2產業、試劑準(zhǔn)備

4.2.1擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：

從試劑盒中取出相應(yīng)的一步法RT-PCR反應(yīng)液滿意度、RT-PCR混合酶，在室溫下融化后可持續，2 000 r/min 離心5 s主要抓手。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測(cè)總數(shù)為n，其中n為被檢樣品構建、陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的和集成應用，每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見下表2。

表 2 每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制表

試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 RT-PCR 混合酶

用量 15 μL 1.0 μL

根據(jù)測(cè)試樣品的數(shù)量計(jì)算好各試劑的使用量大型，加入到適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻明確相關要求，向每個(gè)一步法RT-PCR管中各分裝15 μL重要意義，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)統籌發展。

4.2.2加樣（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）：

在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋緊管蓋體系，500 r/min離心30s生產製造。

4.3、檢測(cè)（在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行）：

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測(cè)儀內(nèi)攜手共進，記錄樣本擺放順序共同。循環(huán)條件設(shè)置如下： 一階段：42 oC/30 min；

第二階段：94 oC/4 min經過；

第三階段：94 oC/1 min, 55 oC/1 min簡單化，72 oC/1 min, 30個(gè)循環(huán)； 第四階段明確了方向，72 oC/8 min系統性；

第五階段，4 oC 保存單產提升。

4.4傳遞、流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽勞動精神，使電泳緩沖液剛好淹沒(méi)膠面開展攻關合作。將10μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和相應(yīng)電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對(duì)照預下達。5 V/cm電泳約0.5 h的有效手段，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增初預(yù)期的特異性DNA電泳帶責任，拍攝并記錄應用情況。

5、結(jié)果判定

5.1一步法RT-PCR后陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條320bp的DNA片段組建。陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有該核酸帶表現。

5.2待測(cè)樣品在相應(yīng) 320 bp DNA 位置上有帶，可判陽(yáng)性深刻變革。

6結論、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3’