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　　1.什么是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染?

　　瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：外源片段的表達(dá)時(shí)間短暫。這主要是因?yàn)橥庠磳?dǎo)入的裸露的載體整合入基因組的幾率非常低表現，所以以染色體外(episomal)形式存在特點，不能隨細(xì)胞分裂而一同復(fù)制導(dǎo)致最后拷貝數(shù)被稀釋導(dǎo)致的。而且考慮到細(xì)胞分裂會(huì)稀釋質(zhì)粒的量結論，所以起初轉(zhuǎn)染的質(zhì)梁椭C共生？截悢?shù)極gao。這就導(dǎo)致瞬時(shí)轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)一個(gè)高拷貝到低拷貝迅速降低的過(guò)程適應性強，且無(wú)法在這個(gè)系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)可誘導(dǎo)表達(dá)技術交流。

　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：是相對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染而言，進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)粒整合入細(xì)胞基因組中相對較高，并能隨細(xì)胞分裂穩(wěn)定傳遞下去資源配置。在這個(gè)系統(tǒng)中，質(zhì)粒表達(dá)穩(wěn)定相關，拷貝數(shù)低大力發展，且能實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并不是一種與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同的方法生產效率，只是對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩選產能提升，得到穩(wěn)定整合的細(xì)胞株適應性。穩(wěn)定整合的幾率因基因傳遞的方法而異，跨度可以從10-8到10-1.因此通過活化，對(duì)于有的轉(zhuǎn)染方法落地生根，比如化學(xué)試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其整合幾乎可以忽略不計(jì)健康發展。質(zhì)粒載體整合的位點(diǎn)并不是wan全隨機(jī)分布有效保障，依據(jù)不同的基因傳遞方法，呈現(xiàn)不同的靶向傾向性長效機製，所以是一種半隨機(jī)整合講實踐。

　　2.設(shè)計(jì)穩(wěn)定株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)需要考慮的因素有哪些?

　　穩(wěn)定整合試驗(yàn)中需要考慮的幾個(gè)關(guān)鍵因素有：

　　1)，外源插入片段的拷貝數(shù)製高點項目。多數(shù)情況下為產業發展，低拷貝甚至是單拷貝可以減少人為實(shí)驗(yàn)因素的干擾。

　　2)有所增加，整合的幾率各項要求，這不僅決定了穩(wěn)定株篩選的難易程度，而且還可以幫助人們更容易得到混合穩(wěn)定株越來越重要的位置。

　　3)新技術，整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活躍度，決定了穩(wěn)定株中外源片段的表達(dá)質(zhì)量順滑地配合。最li想的狀況是單拷貝深入，但轉(zhuǎn)錄活性比較高。

　　4)前沿技術，整合后的穩(wěn)定性基礎。不同的整合位點(diǎn)決定了外源片段在染色體中的穩(wěn)定性，有些區(qū)域易發(fā)生重組或者丟失拓展基地，從而導(dǎo)致穩(wěn)定株再次丟失的情況集中展示。

　　5)，zui,好使用混合穩(wěn)定株或者獲得多個(gè)不同單克隆穩(wěn)定株體系流動性。因?yàn)榉€(wěn)定整合往往伴隨這插入失活宿主內(nèi)源基因探索創新，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)通過(guò)使用混合穩(wěn)定株，或者對(duì)多個(gè)單克隆穩(wěn)定株進(jìn)行比較實現了超越，可以幫助研究人員獲得更精確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)新產品。

　　3. 什么時(shí)候需要穩(wěn)定細(xì)胞株?

　　以下實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株而不是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染更能滿足實(shí)驗(yàn)要求：

　　1)橋梁作用，外源片段在分裂細(xì)胞中長(zhǎng)期(>2周)穩(wěn)定表達(dá)長遠所需。雖然普通轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)一般只能保證2-4天的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率，但腺病毒載體在多數(shù)分裂細(xì)胞中可以維持2-4周內(nèi)的高轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)周期拓展應用。而非分裂細(xì)胞生產創效，可以使用腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因結構，因?yàn)橄傧嚓P(guān)病毒載體在許多非分裂細(xì)胞中可以保持長(zhǎng)達(dá)1年的高效表達(dá)管理。

　　2)優化上下，需要構(gòu)建使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，這主要是由于：a)模樣，過(guò)表達(dá)基因或者干擾目的基因引起細(xì)胞毒性或者抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等不利因素; b)生產體系，目的基因的過(guò)表達(dá)或者干擾需要時(shí)空特異性。

　　3)很重要，希望控制目的基因過(guò)表達(dá)或者干擾的拷貝數(shù)能力和水平，以避免引入人為因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性。構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究異常狀況。

　　4)研究，部分細(xì)胞種類，病毒載體亦無(wú)法達(dá)到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率應用創新，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定株提高，達(dá)到外源片段的高效表達(dá)。

　　5)的特性，長(zhǎng)期在少數(shù)幾類細(xì)胞中研究幾個(gè)基因的功能交流，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本提供堅實支撐，也極大方便實(shí)驗(yàn)研究還不大。

　　6)，部分蛋白穩(wěn)定性ji強(qiáng)取得明顯成效，瞬時(shí)RNA干擾因?yàn)樽饔弥芷诙碳s定管轄，只能抑制目的基因的表達(dá)，但無(wú)法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白創新的技術，所以需要通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定株實(shí)現(xiàn)更好的基因干擾效果發揮。

　　7)，需要往動(dòng)物體內(nèi)注射表達(dá)有外源片段的細(xì)胞就此掀開。需要構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株長足發展，以防止注射入動(dòng)物體內(nèi)后，很快外源片段表達(dá)丟失穩步前行。

　　8)結構不合理，細(xì)胞個(gè)體差異(同一類細(xì)胞，不同個(gè)體細(xì)胞基因組存在差異)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有干擾逐步改善，需要構(gòu)建單克隆細(xì)胞株去除干擾意見征詢。

　　9)，需要將外源片段插入基因組中大大提高，比如基因敲除的必然要求，基因插入突變篩選等修飾基因組的實(shí)驗(yàn)研究成果。

　　4. 什么時(shí)候不需要構(gòu)建穩(wěn)定株?

　　以下實(shí)驗(yàn)不需要構(gòu)建穩(wěn)定株：

　　1)，希望迅速觀察目的基因過(guò)表達(dá)或者干擾效果完善好。例如在正式實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行的小規(guī)模預(yù)實(shí)驗(yàn)大面積。

　　2)，2-4天的瞬時(shí)表達(dá)已經(jīng)可以達(dá)到具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膯栴}分析，比如檢測(cè)兩個(gè)外源轉(zhuǎn)染的目的蛋白之間的相互作用培養，或者觀察某些細(xì)胞周期抑制，凋亡或細(xì)胞存活相關(guān)基因的細(xì)胞表型更加完善。

　　3)形式，細(xì)胞個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。體外培養(yǎng)非原代細(xì)胞支撐作用，多為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或者癌細(xì)胞日漸深入，細(xì)胞個(gè)體差異大，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或者使用腺病毒/腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)更可以反映細(xì)胞群體行為同時』邮叫v；蛘呤褂媚孓D(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建混合穩(wěn)定株。

　　5. 病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株有什么優(yōu)勢(shì)?

　　化學(xué)試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法和電轉(zhuǎn)產能提升，整合率低適應性，同時(shí)整合位點(diǎn)不穩(wěn)定，易發(fā)生再次丟失的情況充分發揮，而且整合位點(diǎn)一般都在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)之外發展成就，所以并不是理想的穩(wěn)定整合工具。另外重要方式，整合后的拷貝數(shù)是由核內(nèi)的外源DNA局部濃度開展面對面，而不是轉(zhuǎn)染時(shí)的DNA的量決定，而化學(xué)方法在輸入質(zhì)粒載體入核的效率比電轉(zhuǎn)和病毒載體相比要低得多非常重要，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染相同細(xì)胞所用質(zhì)粒載體用量要大大高于其它方法進一步提升，造成入核質(zhì)粒載體量難以控制，這也解釋了為什么化學(xué)轉(zhuǎn)染方法和其它兩種方比營造一處，更傾向于得到串聯(lián)多拷貝改革創新。以上種種因素，導(dǎo)致使用非病毒載體轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建穩(wěn)定株取得顯著成效，成功率低新模式，穩(wěn)定性差，穩(wěn)定克隆株易出現(xiàn)不均一(含有非整合細(xì)胞)等缺點(diǎn)不容忽視。

　　逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由于整合率高組織了，是非常理想的穩(wěn)定株構(gòu)建工具。而且通過(guò)控制逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)條件說服力，理論上可以確保每個(gè)細(xì)胞只有單拷貝插入搶抓機遇。同時(shí)由于病毒載體是通過(guò)病毒重組酶將外源片段整合入染色體中分析，其整合特性和病毒自身整合特性非常相似：偏向于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)段，且整合后非常穩(wěn)定全面闡釋，在傳代100次后仍然保留在宿主基因組中非常激烈。最重要的是整合幾率和所有其它化學(xué)，物理轉(zhuǎn)染方法比集中展示，增加5至6個(gè)數(shù)量實力增強，使得穩(wěn)定株構(gòu)建不再成為實(shí)驗(yàn)研究的障礙體系流動性。由于整合幾率非常高探索創新，所以很容易獲得混合穩(wěn)定株。

　　腺病毒載體整合率和普通轉(zhuǎn)染方法差異不大實現了超越，被認(rèn)為是不能整合的一類病毒載體新產品，因此相關(guān)研究數(shù)據(jù)較少，不建議用來(lái)構(gòu)建穩(wěn)定株橋梁作用。非野生型腺相關(guān)病毒載體(Rep-)整合率較低新品技，但因?yàn)橐吧筒《据d體可以定點(diǎn)將病毒基因組整合于人19號(hào)染色體，所以從安全性和穩(wěn)定性角度來(lái)說(shuō)求得平衡，潛力都非常巨大紮實做。由于諸多因素，研究人員仍然在對(duì)其進(jìn)行改造中至關重要，包括考慮到嚙齒類動(dòng)物不含有人19號(hào)染色體對(duì)應(yīng)的整合位點(diǎn)序列提供深度撮合服務。

　　6. 篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的方法主要有哪些?

　　主要有三類方法：

　　1)單克隆環(huán)法：此類方法多用于整合率低的轉(zhuǎn)染方法或者需要得到單克隆細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)。其優(yōu)點(diǎn)在于工作量小的發生，只需將轉(zhuǎn)染或者病毒載體感染后的細(xì)胞按照一定的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至新皿中組成部分，并使用合適的藥物進(jìn)行篩選，最后在克隆環(huán)的幫助下對(duì)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行挑選新的動力，并在新皿中完成擴(kuò)增的過程中。缺點(diǎn)在于需要對(duì)細(xì)胞密度和藥物濃度繪制致死曲線并選取合適的細(xì)胞密度和藥物濃度進(jìn)行篩選，一些細(xì)小的密度和濃度差別都會(huì)導(dǎo)致難以獲取均一的單克隆廣泛關註，結(jié)果導(dǎo)致獲取的克隆不純促進進步，含有非整合的細(xì)胞。穩(wěn)定整合的細(xì)胞在這樣一類混合細(xì)胞中優勢領先，很快會(huì)失去生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)迎來新的篇章，最終導(dǎo)致失去穩(wěn)定株。 2)96孔單克隆稀釋法：此類方法同樣多用于整合率低的轉(zhuǎn)染方法或者需要得到單克隆細(xì)胞株以及篩選懸浮細(xì)胞穩(wěn)定株的實(shí)驗(yàn)改善。其優(yōu)點(diǎn)在于空白區，理論上可以得到非常均一的單克隆，同時(shí)可以篩選懸浮細(xì)胞穩(wěn)定株信息化。其缺點(diǎn)在于形勢，工作量比較大實踐者。

　　3)逆轉(zhuǎn)錄病毒混合克隆制備法：此類方法適用于需要制備混合穩(wěn)定株。優(yōu)點(diǎn)在于可以在短時(shí)間內(nèi)(1周)獲得穩(wěn)定細(xì)胞株約定管轄，同時(shí)也可以隨時(shí)將細(xì)胞稀釋轉(zhuǎn)移至新皿中獲得單克隆細(xì)胞株數據。缺點(diǎn)在于需要制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

　　7 為什么常規(guī)轉(zhuǎn)染方法篩選穩(wěn)定株異常困難?

　　常規(guī)化學(xué)轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)方法發揮，其整合是非同源重組隨機(jī)整合顯著，幾率非常低(10-8-10-6) ，且這些轉(zhuǎn)染條件下發(fā)生的整合多發(fā)生在轉(zhuǎn)錄非活躍區(qū)或者重復(fù)序列區(qū)開放以來，導(dǎo)致外源片段表達(dá)效率低占，同時(shí)這些整合常常不穩(wěn)定，隨著傳代次數(shù)的增加綜合運用，即使在有壓力選擇的情況下也容易發(fā)生丟失供給。

　　8.為什么病毒載體介導(dǎo)的穩(wěn)定株篩選方法效率要比常規(guī)方法高?

　　逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的染色體整合依賴于病毒重組酶，是一個(gè)酶催化反應(yīng)實事求是，因此效率相比隨機(jī)整合要高多個(gè)數(shù)量級(jí)進行探討。而且整合位點(diǎn)多位于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，因此表達(dá)效率高服務水平。同時(shí)其整合非常穩(wěn)定最新，連續(xù)傳代100代以上仍然保持穩(wěn)定表達(dá)。

　　9. 如何選擇適合的病毒包裝類型進(jìn)行穩(wěn)定株篩選?

　　并非所有的病毒載體都適合用來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定株篩選處理方法，首先需要挑選整合效率高重要作用，整合位點(diǎn)穩(wěn)定的病毒載體。至今為止活動上，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是最you效的可以介導(dǎo)基因整合的病毒載體有望。其次，依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求導向作用，挑選不同整合位點(diǎn)傾向性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體方案。傾向于整合于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的，容易造成下游基因的激活; 而整合于轉(zhuǎn)錄活躍基因內(nèi)的十大行動，容易導(dǎo)致整合區(qū)基因的插入失活左右。

　　10. 病毒載體介導(dǎo)的穩(wěn)定株篩選方法可以適用于任何靶細(xì)胞嗎?

　　雖然普通的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定株的構(gòu)建，然而這一類病毒載體并不能高效感染非分裂細(xì)胞綜合措施，因此對(duì)于這一類分化細(xì)胞可靠保障，可以使用慢病毒載體進(jìn)行穩(wěn)定株構(gòu)建。也可以使用腺相關(guān)病毒載體高效感染非分裂細(xì)胞設計標準，這一類病毒載體雖然整合率低于慢病毒載體開展，但其可以以染色體外形式長(zhǎng)期(數(shù)月至數(shù)年)存在于非分裂細(xì)胞中，因此可以避免進(jìn)行穩(wěn)定株篩選。

　　11. 為什么穩(wěn)定株構(gòu)建服務(wù)中不使用腺病毒載體?

　　腺病毒載體由于其整合幾率極低意向，被普遍認(rèn)為是不具備整合能力的病毒載體意料之外，所以一般不用來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定株構(gòu)建。

　　12. 單克隆穩(wěn)定株和混合克隆穩(wěn)定株有什么區(qū)別?我該選擇哪一類用于我的實(shí)驗(yàn)?

　　單克隆穩(wěn)定株顧名思義來(lái)源于含有穩(wěn)定整合外源片段的單個(gè)細(xì)胞的擴(kuò)增形式，而混合穩(wěn)定株則由多個(gè)單克隆穩(wěn)定株構(gòu)成的克隆群置之不顧，不同的單克隆其外源片段的整合位點(diǎn)不一樣。由于體外細(xì)胞多屬于細(xì)胞系數字化，其基因組呈現(xiàn)不穩(wěn)定的特點(diǎn)方便，因此即使是同類細(xì)胞，不同細(xì)胞個(gè)體基因組背景都存在差異深刻內涵。當(dāng)需要去除細(xì)胞群體干擾因素的時(shí)候傳遞，推薦使用單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株，其基因組背景相對(duì)單一交流等，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾因素小更加廣闊。當(dāng)進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)研究時(shí)，多考慮這類因素提高。同時(shí)也是由于不同細(xì)胞個(gè)體差異大，而且不同整合位點(diǎn)的單克隆細(xì)胞株表現(xiàn)出來(lái)的細(xì)胞行為可能不一致進入當下，所以許多實(shí)驗(yàn)使用混合克隆株更能去除細(xì)胞間差異造成的干擾紮實。混合穩(wěn)定株可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒直接篩選獲得新體系，或者通過(guò)講眾多不同的單克隆穩(wěn)定株混合獲得投入力度。前者無(wú)論是是從質(zhì)量，還是時(shí)間周期來(lái)看都更好不難發現。

　　13. 怎么判別篩選的穩(wěn)定株是單克隆?

　　1)貢獻法治，如果外源片段含有熒光標(biāo)記，可以直接使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光是否均一; 如果還有其它標(biāo)簽發展需要，可以進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記攻堅克難，再使用流式細(xì)胞儀觀察熒光分布是否出現(xiàn)均一峰值。因?yàn)椴煌瑔慰寺∮捎谡衔稽c(diǎn)不一樣顯示，其表達(dá)強(qiáng)度也會(huì)受附近染色體結(jié)構(gòu)的影響雙向互動，出現(xiàn)差異。

　　2)設計能力，如果外源片段不含任何標(biāo)簽或者熒光標(biāo)記品牌，則可以使用分子生物學(xué)比如Southern Blot的方法鑒定。

　　3)更為一致，使用96孔板稀釋法篩選等形式，得到的陽(yáng)性克隆一般是單克隆。因?yàn)樽畛跞绻煊蟹钦霞?xì)胞，則含有整合外源片段的單細(xì)胞多半會(huì)失去生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)飛躍，無(wú)法得到陽(yáng)性克隆服務品質。使用單克隆環(huán)法，如果挑取的是致密組成部分，單一的克隆集成，那么多半也是單克隆。

　　14.如何判別篩選的穩(wěn)定株是100   互動講，%含有外源整合片段的細(xì)胞群?

　　通過(guò)觀察所攜帶的熒光標(biāo)記或者對(duì)外源插入片段進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記可以判斷穩(wěn)定株是否混有非整合細(xì)胞穩定性。

　　15.為什么有的時(shí)候構(gòu)建RNAi穩(wěn)定株對(duì)達(dá)到高效的基因干擾效果是必須的?

　　RNA干擾效應(yīng)主要是影響目的基因所表達(dá)的mRNA的穩(wěn)定性或者翻譯，并不影響已經(jīng)存在的目的蛋白的狀態(tài)過程中。部分蛋白其穩(wěn)定性異常高去突破，即使mRNA的表達(dá)水平或者翻譯受到干擾，目的蛋白仍然可以在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)發(fā)揮功能達到。因此需要進(jìn)行穩(wěn)定株篩選智能設備，以挑取干擾效果好的細(xì)胞克隆進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在一些極duan情況下蓬勃發展，甚至需要進(jìn)行第2輪穩(wěn)定株篩選特點，才能獲得一個(gè)比較好的RNA Knock down細(xì)胞株。