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光片熒光顯微鏡

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diSPIM是一種靈活和易于使用的實(shí)施選擇性平面照明顯微鏡(的SPIM)新創新即將到來,允許雙視圖(d樣品的)應用提升,而安裝在一個(gè)倒置顯微鏡上(即SPIM的物鏡是直立)。diSPIM由NIH / NIBIB和應(yīng)用科學(xué)儀器(ASI)的Hari Shroff實(shí)驗(yàn)室共同開發(fā)創造性。SPIM也稱為光片熒光顯微鏡或LSFM,因?yàn)樗褂霉馄蚬馄矫娲怪庇诔上穹较蛘樟翗悠贰?

什么是SPIM或LSFM基礎?

選擇性平面照明顯微鏡(SPIM)是一種快速而柔和的成像技術(shù)性能,將寬視野成像的速度與適度的光學(xué)切片和低的光漂白結(jié)合在一起。它已成為重要的熒光成像方式,尤其是對于體積成像技術創新。SPIM也稱為光片熒光顯微鏡(LSFM)或簡稱為“光片”深入交流研討。 SPIM或LSFM的定義特征是從側(cè)面對焦平面進(jìn)行平面照明。在任何給定時(shí)間僅照亮樣品的一小部分廣泛應用,從而使光損傷最小化關註度,并且提供光學(xué)切片,與寬視野落射熒光相比哪些領域,可以提高SNR敢於挑戰。由于以廣角(二維平行)方式收集圖像,因此建立和完善,光片成像比點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡要快得多提供了遵循,點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡一次只能檢測一個(gè)像素。
光學(xué)薄片顯微鏡由于以下三個(gè)關(guān)鍵特性而迅速在體積成像中獲得普及:首先大型,由于將激發(fā)限制在焦平面附近服務效率,因此光損傷最小化,例如重要意義,生物存活的時(shí)間更長統籌發展。第二,獲得良好的光學(xué)切片體系,通常接近共聚焦顯微鏡生產製造。第三,采集速度非彻矂撦x煌?炀哂兄匾饬x,比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡快幾個(gè)數(shù)量級。 SPIM的主要缺點(diǎn)是大部分,需要額外的光學(xué)器件來生成光片強大的功能。見的是,將一個(gè)單獨(dú)的照明物鏡與檢測物鏡正交放置解決方案,并將產(chǎn)生紙張的光學(xué)器件放置在該照明物鏡和激光源之間優勢。添加額外的鏡頭會給成像系統(tǒng)和樣品安裝帶來空間限制。從本質(zhì)上講增產,顯微鏡需要圍繞樣品進(jìn)行設(shè)計(jì)提供堅實支撐,因此存在各種各樣的光片顯微鏡設(shè)計(jì),每種設(shè)計(jì)都不同的樣品和不同的安裝要求高產。相比之下信息化技術,傳統(tǒng)的共聚焦或落射熒光顯微鏡只有一條光路,可以容納更多種類的樣品良好。換句話說逐步顯現,SPIM的優(yōu)點(diǎn)是以任何單個(gè)工具的適用范圍更窄為代價(jià)的銘記囑托。

方案

將兩個(gè)物鏡以直角放置在水平安裝在開放式培養(yǎng)皿中的樣品上方,每個(gè)物鏡與垂直方向成45度角自動化裝置。從一個(gè)物鏡創(chuàng)建一個(gè)光片示範,并使用另一個(gè)物鏡對其進(jìn)行成像。通過將光片移動(dòng)通過樣品來收集一堆圖像有很大提升空間。對于某些應(yīng)用程序運行好,單個(gè)視圖或堆棧中的3D信息就足夠了(iSPIM)。對于雙視圖系統(tǒng)可能性更大,兩個(gè)物鏡的作用相反部署安排,以從垂直方向收集另一個(gè)堆棧,然后可以將兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行計(jì)算合并以生成具有各向同性分辨率的3D數(shù)據(jù)集(克服了通常的軸向分辨率差的問題從其他視圖獲取信息)關鍵技術。因此了解情況,雙視圖diSPIM具有兩條(通常是對稱的)光路,包括兩個(gè)掃描儀和兩個(gè)攝像頭技術研究。
diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上重要的,包括ASI的RAMM框架。diSPIM系統(tǒng)可以從各種系統(tǒng)集成商處獲得姿勢。各種開源和專有軟件包可用于數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理相互融合。不論所使用的系統(tǒng)集成商和軟件如何,大多數(shù)底層顯微鏡硬件都是相同的綠色化。
diSPIM目標(biāo)的選擇是有限的不同需求,因?yàn)樗鼈儽仨毠餐劢苟换ハ嗯鲎病iSPIM的物鏡是40倍水浸物鏡保持穩定,NA為0.8(Nikon CFI Apo 40XW NIR)總之。奧林巴斯20x / 0.5物鏡是另一種可能性1)尼康10x / 0.3。ASI和Special Optics共同開發(fā)了一種適用于diSPIM的透明組織物鏡支撐作用,該物鏡可以以平板形式或在12 mm球形包膜中對高達(dá)5 mm深的透明組織進(jìn)行成像研學體驗。單面系統(tǒng)(iSPIM)具有更大的靈活性,因?yàn)檎彰魑镧R可以是低NA長WD物鏡效高性。 sCMOS相機(jī)于SPIM成像模式。配備了Hamamatsu Flash4,Andor Zyla提升,PCO Edge和Photometrics Prime 95B相機(jī)的diSPIM系統(tǒng)高品質。 ASI制造了緊湊的光纖耦合2D振鏡或“掃描儀”,它是系統(tǒng)的組成部分支撐能力。掃描儀的原始版本通過在一個(gè)軸上進(jìn)行快速掃描來創(chuàng)建光片資源優勢,并使用另一個(gè)軸將光片移動(dòng)通過樣品2)。還提供帶有圓柱透鏡的掃描儀版本特征更加明顯,用于產(chǎn)生靜態(tài)光片估算。激發(fā)激光(或激光發(fā)射)的輸出被簡單地饋送到掃描儀中講實踐。使用2×1光學(xué)開關(guān)或雙輸出激光發(fā)射非常有幫助,這樣激發(fā)就可以全部引導(dǎo)到有源光路中的掃描儀奮戰不懈。
對于需要環(huán)境控制的應(yīng)用,diSPIM可以輕松地配備恒溫箱外殼和適當(dāng)?shù)脑O(shè)備措施,以保持樣品的存活和快樂大大縮短。 底部物鏡(倒置顯微鏡)通常具有較低的放大倍率物鏡和較便宜的用于定位樣品的照相機(jī)【o密相關?梢暂p松添加落射照明更默契了。

優(yōu)勢

像其他光片技術(shù)一樣,diSPIM僅照亮聚焦平面培訓,因此是使活細(xì)胞和生物成像的理想選擇不合理波動,因?yàn)樗販p少了光漂白和光毒性效應(yīng)。與傳統(tǒng)或旋轉(zhuǎn)盤共焦系統(tǒng)相比重要工具,軸向分辨率提高了約2倍積極拓展新的領域,光漂白減少了10倍以上,速度可與旋轉(zhuǎn)盤媲美更優質。查看與confocal的更詳細(xì)的比較相對開放。 與許多其他光片實(shí)現(xiàn)相比,diSPIM的主要優(yōu)勢在于脫穎而出,與倒置顯微鏡類似拓展應用,樣品的安裝非常簡單。見的是結構,將標(biāo)本放在24 x 50 mm的蓋玻片上管理,蓋玻片固定在一個(gè)特殊的腔室中,該腔室可容納浸漬介質(zhì)雙重提升。具有開放式安裝的其他燈片實(shí)現(xiàn)不具有各向同性分辨率戰略布局。查看光片法的更詳細(xì)比較。 除了方便定位樣品外求索,底部物鏡還可用于光操縱(包括光遺傳學(xué))或其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)讓人糾結。它也可以用來提供樣本的第三張獨(dú)立視圖。這種靈活性也是diSPIM的優(yōu)勢穩定發展。 diSPIM是一種模塊化顯微鏡基石之一,因此可以根據(jù)您的特定需求進(jìn)行多種變化和添加。NIH研究人員增持能力,Applied Scientific Instrumentation等正在探索各種新功能和改進(jìn)共同努力。請參閱部分變體列表。 diSPIM系統(tǒng)可從多個(gè)系統(tǒng)集成商處購買追求卓越。與其他商用輕型薄板解決方案相比逐漸完善,它們便宜且靈活參與能力。與定制的SPIM / LSFM系統(tǒng)相比,它們易于獲取是目前主流,使用和維護(hù)充分發揮。另請參見SPIM技術(shù)的更完整的技術(shù)比較。

配置

ASI提供了所有必要的硬件來實(shí)現(xiàn)diSPIM充分發揮,這是一種靈活且易于使用的選擇性平面照明顯微鏡(SPIM)實(shí)現(xiàn)選擇適用,可在安裝在倒置(i)上的情況下實(shí)現(xiàn)樣品的雙視圖(d)。顯微鏡設計。diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上業務指導,包括ASI的RAMM框架。 ASI制造光機(jī)械元件就此掀開,包括電動(dòng)平臺長足發展,用于創(chuàng)建和移動(dòng)光片的2D振鏡,以及壓電物鏡移動(dòng)器穩步前行。需要物鏡結構不合理,激光和照相機(jī)來完成系統(tǒng);用戶可以自己購買其他物品逐步顯現,使用出售diSPIM的各種系統(tǒng)集成商的服務(wù)銘記囑托,或通過ASI購買它們。 diSPIM已在蓋玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞自動化裝置,嵌入在學(xué)院凝膠上的細(xì)胞c上成功進(jìn)行了測試開放以來。線蟲和斑馬魚的胚胎,以及許多其他樣本高質量。

單面系統(tǒng)(iSPIM)

從一個(gè)物鏡創(chuàng)建并使用另一物鏡成像的光片提供了有力支撐。通常通過使用掃描儀(galvo)移動(dòng)光片,使光片穿過樣品前景,該掃描器與移動(dòng)成像物鏡的壓電平臺同步進一步意見。
  • 優(yōu)勢:的購置,的共享應用,直接的設(shè)置生產能力。
  • 缺點(diǎn): XY分辨率優(yōu)于Z分辨率。
  • 雙面系統(tǒng)(diSPIM)

    雙方都有光片掃描儀示範推廣,壓電物鏡定位器和相機(jī)堅持好。在實(shí)驗(yàn)過程中,從兩個(gè)視圖中都收集了一堆圖像大幅增加,并且可以將兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行計(jì)算合并以生成具有各向同性分辨率的3D數(shù)據(jù)集(另一個(gè)視圖中的信息克服了通常的軸向分辨率差的問題)特性。如果需要,可以單面模式運(yùn)行等特點。
  • 優(yōu)勢:XY和Z分辨率都非常好–結(jié)合了速度和分辨率建言直達,這是活細(xì)胞成像所的多種。
  • 缺點(diǎn):需要購買更多的硬件。各向同性分辨率所需的數(shù)據(jù)后處理充分發揮。

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