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熒光素酶實驗共謀發展,提供實驗服務

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Luciferase報告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報告系統(tǒng)。然后可以通過熒光測定儀也稱化學發(fā)光儀或液閃測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光創造更多。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系,可以極其靈敏不斷進步、高效地檢測基因的表達工藝技術。是檢測轉錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。熒光素酶實驗規模,提供實驗服務

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轉錄因子是一種具有特殊結構近年來、行使調控基因表達功能的蛋白質分子,也稱為反式作用因子發展目標奮鬥。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合技術先進,這些特異性的序列被稱為順式作用元件,轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現(xiàn)共價結合延伸,從而對基因的表達起抑制或增強的作用認為。熒光素酶報告基因實驗(luciferase assay)是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。

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其原理簡述如下:


1)構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒反應能力,如pGL3-basic等。


2 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系學習。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子結構重塑,則熒光素酶基因就會表達,熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比措施。


3 加入特定的熒光素酶底物大大縮短,熒光素酶與底物反應,產生熒光,通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性更默契了,從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用先進技術。

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技術流程:


1 用生物信息學方法分析并預測啟動子區(qū)可能的轉錄因子結合位點深入。


2)設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段,將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒(pGL3-basic)中前沿技術。


3)篩選陽性克隆基礎,測序。擴增克隆并提純質粒備用多種方式。


4 擴增轉錄因子質粒對外開放,提純備用。同時準備相應的空載質粒對照深入交流研討,提純備用資料。


5 培養(yǎng)293(或其它目的細胞),并接種于24孔板中關註度,生長10-24小時(80%匯合度)橫向協同。


6 將報告基因質粒與轉錄因子表達質粒共轉染細胞。


7)提取蛋白并用于熒光素酶檢測敢於挑戰。


8 加入底物不斷創新,測定熒光素酶的活性。


9 計算相對熒光強度提供了遵循,并與空載對照比較參與水平。

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