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資料簡介
該試劑盒用于從克隆菌中大量提取去除內(nèi)毒素的高品質(zhì)質(zhì)粒，一般來說可從200ml過夜培養(yǎng)的菌液中提取高拷貝質(zhì)粒600-1200ug明確了方向，低拷貝質(zhì)粒50-400ug系統性。試劑盒自帶的說明書為英文說明書，不是非常方便閱讀改進措施，所以本文根據(jù)英文原版重新翻譯了一遍就此掀開，希望對大家有幫助。
實驗前準(zhǔn)備
1. 使用前,將RNase A全部加入Solution I中并于4度保存今年。
2. 按下表用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer穩步前行，并于室溫保存。
試劑盒型號 加入的乙醇量(ml)
D6926-00B 60
D6926-01B 160
D6926-03B 200
D6926-04B 200每瓶
細(xì)菌的培養(yǎng)：
1. 在容積為1-4升的培養(yǎng)瓶中加入200ml含篩選抗生素的LB培養(yǎng)基動手能力，加入含目的質(zhì)粒的克隆菌(一般為1/1000比例接種逐步改善，也即200ul)，然后置37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時提升。為了獲得*的效果大大提高，*接菌使用經(jīng)過夜培養(yǎng)活化的菌種。對于大多數(shù)質(zhì)粒的提取研究成果，我們強烈*使用endA陰性的菌種取得了一定進展，比如DH5α和JM109。
*的培養(yǎng)條件對于質(zhì)粒DNA的得率至關(guān)重要大面積。*的培養(yǎng)條件包括積極參與，首先由新轉(zhuǎn)化或新劃線的培養(yǎng)板中挑取單個克隆，然后接種于2-5ml含合適篩選抗生素的培養(yǎng)基中培養，37℃振蕩(搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定在約300rpm為宜)培養(yǎng)約8小時技術；然后繼續(xù)接種于含抗生素的預(yù)熱的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩(~300rpm)培養(yǎng)12-16小時推動。盛培養(yǎng)基的容器的容積需至少為培養(yǎng)基體積的3-4倍(注：保證培養(yǎng)環(huán)境中有足夠的氧氣相對較高，防止厭氧菌的繁殖)，初始培養(yǎng)基接種的稀釋比例為1/500到1/1000為宜信息。
為了獲得*的效果相關，我們*每次培養(yǎng)后測定OD600值。對于過夜培養(yǎng)活化的細(xì)菌而言豐富內涵，OD600的值處于1.5-2.0之間是細(xì)菌生長良好的指標(biāo)生產效率。在測定OD600時，為了保證測量值處于光度計測量的線性范圍(0.1-0.5)適應性，需將培養(yǎng)物進行必要的稀釋(10到20倍)節點。當(dāng)接種進行大量培養(yǎng)時，我們*細(xì)菌的終密度在2.0-3.0之間為宜落地生根。當(dāng)使用富營養(yǎng)的培養(yǎng)基的特點，需要注意保證細(xì)菌的密度不要超過OD600為3.0；如果使用凍存的甘油菌開展面對面，需要首*行劃線并挑取單克隆系統，然后和前面一樣進行必要的活化。
富營養(yǎng)培養(yǎng)基如2xYT或TB進一步提升，不*使用本試劑盒空間廣闊。
堿性-SDS溶液裂解細(xì)菌：
2. 取100-200ml菌液3,500-5,000xg室溫離心10min收集菌體沉淀。
3. 小心去除上清液改革創新，為了保證所有上清去除*知識和技能，可使用干凈的紙巾將容器壁上液滴吸除，加10ml Solution Ⅰ/RNase A , 渦旋或用移液槍上下吹打重懸菌體新模式，重懸*對于獲得zui高的得率至關(guān)重要;
4. 加10ml SolutionⅡ實現，來回顛倒10-15次輕柔混勻，以得到澄清的裂解液講理論。如有必要可室溫孵育2min的可能性。
避免混合時動作過于劇烈，過于劇烈會剪切細(xì)菌的染色體DNA(從而在接下來的步驟中不能被充分沉淀)并且導(dǎo)致質(zhì)粒的純度降低服務為一體。(當(dāng)Solution II在不使用時問題，需要將瓶蓋旋緊，防止空氣中的CO2與Solution II反應(yīng)生成碳酸鹽)
5. 加5ml Buffer N3全會精神，輕輕顛倒充分混勻幾次直至白色絮狀沉淀出現(xiàn)系統穩定性。室溫放置2—3min，期間偶爾顛倒混合集中展示，以使其充分反應(yīng)實力增強。
注意：該溶液必須充分混合。如果混合物依然非常的粘滯，呈褐色并且成團狀帶來全新智能，則需要進一步混合以充分中和該溶液實現了超越，充分中和對于獲得更好的得率至關(guān)重要。使用冰預(yù)冷的Buffer N3將有利于沉淀更多的細(xì)菌蛋白去完善。
6. 準(zhǔn)備結(jié)合柱：加5ml的Buffer GPS至結(jié)合柱中橋梁作用，室溫放置3—10min，3,000—5,000×g室溫離心5min求索，棄濾液(注：這里中文說明書中添加了一步“往柱子里加入10ml無菌水離心棄濾液”讓人糾結，而在英文原版中是沒有的)，把柱子插回50ml收集管中穩定發展。(注：這里可以使用一個舊的50ml離心管收集廢液至關重要，而將試劑盒中附帶的新離心管用于zui后一步質(zhì)粒洗脫時使用)。
使用針筒式過濾器過濾裂解物：
7. 將第5步得到的裂解液及沉淀物全部轉(zhuǎn)移至針筒式過濾器中服務品質，準(zhǔn)備一個干凈的50ml離心管收集濾液的發生。將過濾器的活塞插回針筒。
8. 將針筒對準(zhǔn)50ml收集管表現明顯更佳，輕輕推動活塞狀態，收集澄清的濾液。一些裂解液中可能仍然殘留有絮狀沉淀物指導，不要強行將這些殘留的裂解液推擠過柱廣泛認同。
9. 加入等體積的ETR Binding Buffer(~25ml)到結(jié)合柱上，上下反復(fù)顛倒7-10次流動性。
使用HiBind結(jié)合柱純化質(zhì)粒DNA(注：離心法鍛造，適用于同時抽提多個樣品，對于樣本量較少時持續創新，*使用后面的真空抽濾法)
10. 小心轉(zhuǎn)移裂解液至HiBind結(jié)合柱改善，3,000—5,000×g離心3—5min,使液體濾過柱子，棄濾液協調機製。
11. 重復(fù)步驟10信息化，直至所有裂解液都過濾完，棄濾液實踐者。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結(jié)合柱上取得明顯成效，3,000—5,000×g離心3—5min,使全部液體濾過柱子，棄濾液數據。
13. 加入10ml Buffer EHB到結(jié)合柱上創新的技術，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液顯著。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer(預(yù)先添加了乙醇)到結(jié)合柱上快速增長，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
注意：試劑盒附帶的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標(biāo)簽的提示用無水乙醇稀釋高質量。如果試劑是低溫保存的提供了有力支撐，使用前需要預(yù)先恢復(fù)溫度至室溫。
15. 加入10ml DNA Wash Buffer到結(jié)合柱上3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子逐步改善，棄濾液意見征詢；
16. 把空柱子套回離心管，zui大轉(zhuǎn)速(不超過6,000×g)離心10—15min使柱子充分干燥持續。不要跳過該步驟-該步對于去除柱子中殘留的乙醇非常關(guān)鍵。
使用HiBind結(jié)合柱純化質(zhì)粒DNA(注：真空抽濾法再獲，對于樣品個數(shù)較少時產品和服務，該方法比較節(jié)省時間)
10. 安裝好抽濾裝置，將結(jié)合柱與抽濾瓶密閉結(jié)合
11. 轉(zhuǎn)移裂解液至HiBind結(jié)合柱體驗區，使液體全部濾過柱子增多。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結(jié)合柱上，洗滌一次(注：流速可能會比較慢)有望。
13. 加入10ml Buffer EHB到結(jié)合柱上進一步推進，洗滌一次。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer(預(yù)先添加了乙醇)到結(jié)合柱上方案，洗滌一次應用的選擇。
15. 再次加入10ml DNA Wash Buffer，洗滌一次左右。
16. 繼續(xù)抽真空10-15min背景下，以充分干燥結(jié)合柱(注：當(dāng)抽提多個樣品時，可以選擇離心法步驟16中的方法以節(jié)約時間)可靠保障。
由結(jié)合柱洗脫質(zhì)粒DNA(常規(guī)方法自然條件，也可以使用后面介紹的另一種洗脫方法)
17. 進一步干燥柱子：選擇以下任一種方法在洗脫前進一步干燥結(jié)合柱
A. 將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移真空抽濾裝置上室溫抽濾15min
B. 將結(jié)合柱放入65℃恒溫烤箱，烘烤10—15min
18. 把結(jié)合柱套在一個新的50ml離心管中(注：可以使用試劑盒附帶的離心管)開展，加入1—3ml(注：依據(jù)要求的質(zhì)粒終濃度互動互補，可以分步兩次洗脫，第1次少量洗脫保證得到高濃度的質(zhì)粒意向，第二次稍加大洗脫體積意料之外，保證盡可能將質(zhì)粒洗脫*) Endotoxin-Free Elution Buffer(或去離子水)至結(jié)合柱的膜上，室溫放置2—5min開展面對面，以zui高轉(zhuǎn)速離心(不超過6,000xg)5min洗脫質(zhì)粒DNA系統。
上面描述的方法可以回收大約60-80%柱結(jié)合的DNA。也可以選擇進行二次洗脫從而將所有殘留的DNA全部回收進一步提升，但二次洗脫的DNA濃度會低一些空間廣闊。另外，第二次洗脫也可以使用*洗脫下來的液體以保證得到較高濃度的質(zhì)粒DNA。將洗脫液或去離子水預(yù)熱至70℃并且在洗脫前知識和技能，室溫放置2min取得顯著成效，可能會顯著提升zui終的得率。
注意：使用該方法得到的質(zhì)粮訌V闊？梢院芎玫膽?yīng)用與PCR規劃，限制性酶切，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等可以使用。預(yù)期的質(zhì)粒濃度可能依據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)不同存在一些出入進入當下。但是，一般來說高拷貝的質(zhì)粒終濃度在150-600ug/ml效高化。該方法得到的質(zhì)列麦w系？赡軙恍┮掖?xì)埩簦话悴粫绊懴掠螌嶒瀯撛?。如果需要獲得更高的質(zhì)粒濃度和*去除乙醇?xì)埩舨浑y發現，可以選擇使用下面的方法。
另一種結(jié)合柱洗脫質(zhì)粒DNA的方法
1. 把結(jié)合柱套在一個新的50ml離心管中(注：可以使用試劑盒附帶的離心管)設備製造，加入6ml Endotoxin-Free Elution Buffer(或去離子水)至結(jié)合柱的膜上發展需要，室溫放置2min，以zui高轉(zhuǎn)速離心(不超過6,000xg)5min以洗脫質(zhì)粒DNA管理。將洗脫液或去離子水預(yù)熱至70℃并且在洗脫前顯示，室溫放置2min，可能會顯著提升zui終的得率新型儲能。
2. 將洗脫的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到一個干凈的適用于沉淀的離心管中創新能力。加入260ul 5M NaCl以及4.4ml室溫放置的異丙醇。渦旋以充分混勻範圍，然后以不低于15,000×g轉(zhuǎn)速4℃離心30min求得平衡。小心地去除上清。
3. 用2ml 70%的乙醇洗滌沉淀一次空間廣闊，以不低于15,000×g轉(zhuǎn)速4℃離心10min至關重要，小心地去除上清》掌焚|？諝飧稍锍恋?-10min的發生。
4. 加入200-500ul(依據(jù)要求的質(zhì)粒終濃度)Endotoxin-Free Eluiton Buffer或去離子水重懸DNA。
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