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生化培養(yǎng)箱在多管發(fā)酵法的應(yīng)用

1 .多管發(fā)酵法

　　初發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 發(fā)酵管內(nèi)裝有單倍或三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，并在內(nèi)倒置有小玻璃管的特性。每個(gè)樣品用三個(gè)不同的水樣量接種，同一接種水樣量要有五管基礎，將水樣分別接種到裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中提供堅實支撐，在37℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h。乳糖能起選擇作用高產，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖信息化技術，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。培養(yǎng)液中加入溴甲酚紫作為酸度指示劑良好，細(xì)菌產(chǎn)酸后逐步顯現，培養(yǎng)液即由原來的紫色變成黃色。產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗(yàn)陽性顯著，如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯快速增長，可輕拍發(fā)酵管，有小氣泡升起為陽性占。

　　復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 輕微振蕩初發(fā)酵試驗(yàn)陽性結(jié)果的發(fā)酵管高質量，用3mm接種環(huán)將培養(yǎng)物(2-3環(huán))轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中，在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h(提高培養(yǎng)溫度可造成不利于來自自然環(huán)境的大腸菌群的生長(zhǎng))激發創作。培養(yǎng)后立即觀察前景，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實(shí)為糞大腸菌群陽性。

　　2.濾膜法

　　濾膜是一種微孔性濾膜增幅最大，孔徑0.45μm共享應用。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的過濾器中生產能力，經(jīng)過抽濾，細(xì)菌即被截留在膜上示範推廣，然后將濾膜貼于M-FC培養(yǎng)基上完善好，在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h±2h。糞大腸菌群菌落在M-FC培養(yǎng)基上呈藍(lán)色或藍(lán)綠色積極參與，其他非糞大腸菌群菌落成灰色問題分析、淡黃色或無色。正常情況下交流研討，由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用更加完善，在M-FC培養(yǎng)基上很少見到非糞大腸菌菌落。

　　二.兩種方法的注意事項(xiàng)

　　1.培養(yǎng)溫度的要求 總大腸菌群中的細(xì)菌除生活在腸道中外建設應用，在自然環(huán)境中的水與土壤中也經(jīng)常存在支撐作用，但此等在自然環(huán)境中生活的大腸菌群培養(yǎng)的合適溫度為25℃左右，如在37℃培養(yǎng)則仍可生長(zhǎng)動力，但如將培養(yǎng)溫度再升高至44.5℃同時，則不再生長(zhǎng)，而直接來自糞便的大腸菌群細(xì)菌效高性，習(xí)慣于37℃左右生長(zhǎng)模式，如將培養(yǎng)溫度升高至44.5℃仍可繼續(xù)生長(zhǎng)。因此提升，可用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分高品質，兩種方法也都基于此理。將接種好的樣品或裝有濾膜的培養(yǎng)基放入 培養(yǎng)皿要沉到水浴箱底部支撐能力。

　　2.加氯水樣的處理 經(jīng)氯處理消毒過的水樣資源優勢，水中含有一定量的余氯，使大腸菌群處于受損或受抑制狀態(tài)置之不顧，在采集水樣時(shí)應(yīng)提前在采樣瓶中加*不斷完善，*可以脫氯，使受損的細(xì)菌得以復(fù)蘇與修復(fù)方便，從而避免出現(xiàn)計(jì)數(shù)結(jié)果偏低甚至假陰性的現(xiàn)象基礎上。此外余氯對(duì)濾膜法培養(yǎng)的細(xì)菌其抑制作用尤為明顯，所以抽濾時(shí)應(yīng)對(duì)水樣進(jìn)行大量無菌水稀釋知識和技能，以減少余氯的殘留取得顯著成效。

　　3.樣品的保存 采樣用的容器使用前應(yīng)蓋好瓶蓋，用牛皮紙將瓶蓋和瓶頸處包裹好實現，置干燥箱160℃-170℃干熱滅菌2h不容忽視，或用高壓蒸汽滅菌器121℃滅菌15min。采樣后水樣的正確保存也很重要，如保存不當(dāng)可使樣品中的大腸菌群細(xì)菌死亡或在一定條件下再生長(zhǎng)說服力，這些都將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性搶抓機遇。檢測(cè)室接到水樣后，應(yīng)立即檢測(cè)表示，如因故不能檢測(cè)時(shí)全面闡釋，應(yīng)立即將樣品置于冰箱內(nèi)(2℃-10℃)并于2小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

　　4.培養(yǎng)物質(zhì)的制備與保存

　「偁幜λ?、?多管發(fā)酵法所使用的培養(yǎng)液在分裝于各發(fā)酵管中后引人註目，應(yīng)將發(fā)酵管盡快放于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min(注意：這個(gè)溫度也應(yīng)控制好溝通機製，既達(dá)到滅菌的作用好宣講，還要防止培養(yǎng)物質(zhì)分解流失)，然后貯存于冰箱或暗處備用領先水平。

　?、?濾膜法所采用的M-FC培養(yǎng)基多使用外購(gòu)的成品，培養(yǎng)基中苯胺藍(lán)的純度和質(zhì)量往往影響菌落的顏色戰略布局，因此事關全面，無菌包裝的成套培養(yǎng)基在使用前，先接種典型糞大腸菌狀態，以觀察對(duì)比菌落的顏色技術節能，來鑒定其穩(wěn)定性。

　　5.結(jié)果統(tǒng)計(jì)

　≈陵P重要、?多管發(fā)酵法的結(jié)果是根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目提供深度撮合服務，從MPN表中查得相應(yīng)的MPN指數(shù)，來計(jì)算每升水中糞大腸菌群細(xì)菌的MPN值的發生。MPN是“Most Probable Number”的縮寫，指大可能數(shù)影響，它是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論新的動力，估計(jì)水體中的菌群密度和衛(wèi)生質(zhì)量的一種方法，所以準(zhǔn)確判斷不同接種量發(fā)酵管的陽性數(shù)是非常重要的發展契機，否則將導(dǎo)致較大偏差廣泛關註。

　　⑵.濾膜法的結(jié)果是計(jì)數(shù)濾膜上呈藍(lán)或藍(lán)綠色的菌落發力，來計(jì)算出每升水樣中的糞大腸菌群數(shù)優勢領先。所以為便于計(jì)數(shù)，減少誤差共創美好，理想的水樣體積是一片濾膜上生長(zhǎng)20-60個(gè)糞大腸菌群菌落推動並實現。

　　三.在實(shí)際中的應(yīng)用探討

　　1.檢測(cè)方法對(duì)樣品的適用性

　⑴.多管發(fā)酵法由于只需要根據(jù)水樣的取樣量來決定將樣品培養(yǎng)于何種培養(yǎng)液中(單倍或是三倍乳糖)進(jìn)行培養(yǎng)，因此理論上可適用于各種水樣優化程度，但由于受發(fā)酵管容積的限制積極性，其更適合檢測(cè)水源水、地表水和污染源廢水(取樣量不大)不斷豐富，而且如果接種的水樣量不是MPN表中的三種接種量時(shí)實施體系，還需用公式進(jìn)行換算。

　「饔袃瀯?、?濾膜法主要是采用抽濾裝置將細(xì)菌截留在濾膜上效果較好，然后將濾膜貼附在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此可用于檢測(cè)體積較大的水樣持續，但受濾膜孔徑的限制等多個領域，在檢測(cè)混濁度高(污染源廢水)、非大腸桿菌類細(xì)菌密度大(河湖水)的水樣時(shí)高質量，對(duì)菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)有一定影響提供了有力支撐，此外，如水樣中有毒性物質(zhì)較高前景，也會(huì)在濾膜上形成累積進一步意見，抑制細(xì)菌培養(yǎng)。

　　2.檢測(cè)時(shí)間及操作過程的繁瑣度

　÷涞綄嵦?、?多管發(fā)酵法需要經(jīng)過初發(fā)酵試驗(yàn)和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)兩個(gè)過程后才能根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目服務水平，從MPN表中查得相應(yīng)的MPN指數(shù)，從而后得出每升水中糞大腸菌群細(xì)菌的MPN值技術創新√幚矸椒?？梢钥闯觯喙馨l(fā)酵法的培養(yǎng)時(shí)間至少需要2天以上持續向好，且對(duì)接種量習慣、每一接種量的發(fā)酵管數(shù)都有嚴(yán)格要求(MPN表多采用9管、15管發(fā)酵管進展情況，接種量為10ml的積極性、1ml、0.1ml3種體積查詢)至關重要，否則結(jié)果難以統(tǒng)計(jì)不久前。

　　⑵.濾膜法目前主要采用成套NPS(濾膜+培養(yǎng)基+培養(yǎng)皿)進(jìn)行細(xì)菌截留和培養(yǎng)提升行動，操作簡(jiǎn)單能力建設，使用時(shí)只需用少量無菌水潤(rùn)濕培養(yǎng)基墊即可使用，培養(yǎng)時(shí)間1天左右研究進展，能比多管發(fā)酵法更快地獲得結(jié)果無障礙，還具有高度的再現(xiàn)性和精密性。此外由于采用單片無菌包裝，節(jié)省了滅菌時(shí)間發揮重要帶動作用，還避免操作過程中的二次污染意向，并且長(zhǎng)有菌落的濾膜片可在紫外線滅菌、干燥后作為檢測(cè)記錄保存文化價值，更符合計(jì)量認(rèn)證規(guī)范形式。

　　3.檢測(cè)成本的考慮

　　⑴.多管發(fā)酵法所用的發(fā)酵管不斷完善、小玻璃倒管和塑料蓋可在清洗數字化、高壓滅菌和紫外線消毒后重復(fù)使用，液態(tài)培養(yǎng)基可自行配制或采用市售已配好的綜合培養(yǎng)基基礎上，檢測(cè)的成本不高各領域。由于其方法較繁瑣，目前正有一種經(jīng)過US EPA認(rèn)證的水和廢水中糞大腸菌群檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法逐步取代它保持競爭優勢，這種在美國(guó)進行培訓、日本和加拿大等國(guó)家廣泛使用的檢測(cè)技術(shù)在國(guó)內(nèi)也有一定使用(北京市環(huán)境檢測(cè)中心、北京市排水集團(tuán)檢測(cè)中心等)完成的事情，這種方法就是使用IDEXX colilert試劑來檢測(cè)水中糞大腸菌物聯與互聯，雖然它是基于多管發(fā)酵法原理，不過卻將其操作大大簡(jiǎn)化了改造層面。當(dāng)然供給，伴隨著操作的簡(jiǎn)化，檢測(cè)成本也大幅提高經驗分享，設(shè)備基本上全是進(jìn)口的解決方案，前期投入大概在8萬元至10萬元人民幣之間，且由于采樣瓶有力扭轉、試劑和密封計(jì)數(shù)盤都是一次性使用上高質量，單個(gè)樣品的檢測(cè)成本也將達(dá)到200元人民幣左右。

　V度和深度、?濾膜法主要采用的抽濾裝置(拋光不銹鋼3歧管過濾器攻堅克難、500ml漏斗、無油隔膜真空正壓兩用泵和手動(dòng)無菌水加液器)也基本上來自于進(jìn)口顯示，目前很多單位使用的都是德國(guó)賽多利斯公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，其前期投入大概在2萬元至3萬元人民幣左右(包括100套無菌包裝的NPS效率和安，12元/每套)設計能力。由于每個(gè)樣品需采用3種不同的稀釋比進(jìn)行過濾培養(yǎng)，要使用3套NPS深入開展，所以單個(gè)樣品的檢測(cè)成本在50元人民幣左右更為一致。

　　四.建議

　　從兩者在幾個(gè)方面的比較可以看出，濾膜法具有省時(shí)、省料研究與應用、設(shè)備要求低以及可以采集較多的檢測(cè)水樣等優(yōu)點(diǎn)飛躍，而且隨著應(yīng)急檢測(cè)機(jī)制的建立，當(dāng)需要我們對(duì)各種突發(fā)環(huán)境污染事件(醫(yī)院廢水是否加氯處理全面協議、河湖是否受生活廢水污染)迅速做出反應(yīng)重要部署，更快地獲得肯定結(jié)果的時(shí)候，其優(yōu)點(diǎn)越發(fā)突出工具。

因此在實(shí)際檢測(cè)工作中智慧與合力，我們可以將濾膜法作為主要檢測(cè)方法，并采取措施克服其易受水樣混濁度重要的角色、其它菌種和有毒物質(zhì)干擾的局限性數據顯示，快速反映水質(zhì)情況，為監(jiān)督管理部門提供科學(xué)數(shù)據(jù);將多管發(fā)酵法作為輔助方法也逐步提升，通過其來對(duì)濾膜法培養(yǎng)的可疑菌種進(jìn)行鑒定記得牢，從而使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，只有這樣重要的作用，水中的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)才能順利更多可能性、的開展。