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【中國儀器網(wǎng) 使用手冊】液相色譜(HPLC)法是以高壓下的液體為流動相先進水平，并采用顆粒極細的固定相的柱色譜分離技術(shù)。液相色譜對樣品的適用性廣全面展示，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制重要平臺，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中核心技術，可用氣相色譜分析的約占20%應用提升，而80%則需用液相色譜來分析。
液相色譜和氣相色譜在基本理論方面沒有顯著不同創造性，它們之間的重大差別在于作為流動相的液體與氣體之間的性質(zhì)的差別發展的關鍵。
液相色譜分析原理
(1)、液相色譜分析的流程：由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)規模設備，然后輸出多種方式，經(jīng)流量與壓力測量之后，導(dǎo)入進樣器新創新即將到來。被測物由進樣器注入邁出了重要的一步，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離后進入檢測器設施，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理需求，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶組合運用。遇到復(fù)雜的混合物分離(極性范圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫更讓我明白了。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度積極，而HPLC改變的是流動相極性探索，使樣品各組分在佳條件下得以分離。
(2)產業、液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣滿意度，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力主要抓手、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離體製。
開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個組分創新科技，A服務延伸、B和C，隨流動相一起進入色譜柱具有重要意義，開始在固定相和流動相之間進行分配進一步。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱強大的功能。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時間長實際需求，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A預期，C之間敢於監督，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統(tǒng)結構，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的貢獻。
不同組分在色譜過程中的分離情況簡單化，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力明確了方向、親和力等是否有差異系統性，這是熱力學(xué)平衡問題，也是分離的首要條件單產提升。其次傳遞，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬勞動精神，分離情況與兩相之間的擴散系數(shù)開展攻關合作、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關(guān)預下達。所以分離終效果則是熱力學(xué)與動力學(xué)兩方面的綜合效益的有效手段。
工作原理
儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相) 內(nèi), 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù), 在兩相中作相對運動時, 經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程,各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別, 被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出, 通過檢測器時, 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。
HPLC的特點和優(yōu)點
HPLC有以下特點：
高壓——壓力可達150~300 Kg/cm2方案。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上關鍵技術。
高速——流速為0.1~10.0 ml/min。
——可達5000塔板每米深入。在一根柱中同時分離成份可達100種技術研究。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：
速度快——通常分析一個樣品在15~30 min姿勢，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成相互融合。
分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng適應性強，熒光和電化學(xué)檢測器可達0.1pg技術交流。
柱子可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少拓展，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞創造更多，可以收集單一組分或做制備。
液相色譜的五大系統(tǒng)
1不斷進步、進樣系統(tǒng)
進樣系統(tǒng)分為手動進樣閥和自動進樣器工藝技術。
手動進樣閥
對于手動進樣閥使用過程中需要注意每個樣品進樣完成后應(yīng)對進樣閥進行清洗，防止殘留對下一個樣品分析的影響規模。還需要注意進樣方式近年來，以20μL定量環(huán)為例，我們可以選擇*充滿定量管或部分充滿定量管節點。為了保證進樣的重復(fù)性通過活化，選擇*充滿定量管進樣方式時，需要注入定量環(huán)體積3倍以上的樣品;選擇部分充滿定量管進樣方式時的特點，進樣體積應(yīng)在定量管體積一半以下健康發展，即1-10μL。
自動進樣器
如果采用自動進樣器進樣大數據，首先需要保證注射器里面沒有氣泡存在長效機製，否則影響進樣量準確性;其次是樣品瓶里面有足夠的樣品，保證進樣針能夠吸到樣品數字技術。為了避免交叉污染需要定期對樣品瓶奮戰不懈、蓋和墊進行清洗。若自動進樣器長時間不使用措施，應(yīng)該注意：腐蝕性的流動相或洗液(例如大大縮短，堿性或酸性緩沖溶液)必須*從系統(tǒng)中置換出來。同時更高要求，為了避免細菌的生長越來越重要的位置，應(yīng)將一個樣品瓶中充滿甲醇，并重復(fù)幾次進樣操作共同學習。
2順滑地配合、輸液系統(tǒng)
*按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對液相色譜分析來說效高，*的流量穩(wěn)定性更為重要前沿技術，這是因為流速的變化會引起溶質(zhì)的保留值的變化基礎，而保留值是色譜定性的主要依據(jù)之一。因此多種方式，恒流泵的應(yīng)用更廣泛對外開放。
*按工作方式分為氣動泵和機械泵兩大類。機械泵中又有螺旋傳動*深入交流研討、單活塞往復(fù)泵資料、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。
HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：
a 流量恒定關註度，無脈動橫向協同，并有較大的調(diào)節(jié)范圍(一般為1～10ml/min)；
b 能抗溶劑腐蝕敢於挑戰；
c 有較高的輸液壓力長遠所需；對一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了讓人糾結，對分離規模，要求達到150～300×105Pa。
(1)往復(fù)式柱塞泵結(jié)構(gòu)和原理
當柱塞推入缸體時基石之一，泵頭出口(上部)的單向閥打開聯動，同時，流動相進入的單向閥(下部)關(guān)閉共同努力，這時就輸出少量的流體生產體系。反之，當柱塞向外拉時很重要，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關(guān)閉覆蓋，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中異常狀況。這種泵的特點是不受整個色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動相高效。
(2)氣動放大泵結(jié)構(gòu)和原理
其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動大面積(SA )活塞A應用創新，則在小面積(SB )活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于A和B兩活塞的面積比機構，如果A與B的面積之比為50：1 的特性，則壓力為5×105Pa的氣體就可得到壓力為250×105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵基礎。
泵頭通常由兩部分組成--單向閥和密封圈-柱塞桿.單向閥一般由閥體\塑料\或陶瓷閥座和紅寶石球組成.在壓力的作用下寶石球離開閥座,流動相流過單向閥;反之,在反向力的作用下,寶石球回到閥座上,此時流動相不再流過單向閥.顯然寶石球與閥座之間的配合必須非常適合才能防止流動相的泄漏.為了保證單向閥不發(fā)生泄漏,一些單向閥中安裝了兩套寶石球和閥座,也有一些單向閥是將寶石球用一個合適的彈簧壓在閥座上.在不同的應(yīng)用領(lǐng)域,單向閥閥體的材料有所不同,例如考慮生物兼容性的系統(tǒng),單向閥的閥體往往采用金屬鈦,而不用不銹鋼.為了降低成本和減少維護費用,一些生產(chǎn)廠商還采用了可置換式的卡套式塑料單元件,當然其功能仍保持不變
輸液系統(tǒng)即是指高壓恒流泵提供堅實支撐，其作用是能提供穩(wěn)定準確的流速。
溶劑過濾頭：吸液過濾頭高產，或稱沉子信息化技術，主要作用是過濾流動相中可能存在的顆粒性雜質(zhì)發揮作用。長時間使用后，雜質(zhì)有可能阻塞溶劑過濾頭上的過濾板孔隙;或長時間使用緩沖液逐步顯現，過濾頭表面容易產(chǎn)生一層膜銘記囑托，阻礙流動相正常通過。嚴重時自動化裝置，即使是已超聲過的溶劑示範，泵吸液時也會有氣泡在四氟輸液管里產(chǎn)生，因此應(yīng)經(jīng)常對過濾頭進行清洗有很大提升空間。清洗溶劑可以選擇乙醇或者30%稀硝酸溶液提供了有力支撐，正相系統(tǒng)需注意濾頭的烘干處理。
單向閥：單向閥的作用是確保液體向一個方向流動逐步改善，是高壓恒流泵穩(wěn)定輸液的保證意見征詢。日常使用過程中，可以通過觀察壓力的情況大大提高，初步判斷流量是否正常的必然要求。如果系統(tǒng)已經(jīng)平衡一段時間，壓力應(yīng)該是穩(wěn)定的取得了一定進展。但如果壓力存在波動完善好，則表明流量不穩(wěn)定;如果無壓力，則表明無流量積極參與。這兩種情況大多是因為單向閥里混入了氣泡或雜質(zhì)問題分析。混入氣泡的情況交流研討，應(yīng)把放空閥打開更加完善，按沖洗鍵將里面的氣泡排出。單向閥混入雜質(zhì)的情況建設應用，須對其進行清洗支撐作用。清洗溶劑可以選擇乙醇，安裝時注意標記環(huán)的方向動力。
密封圈：密封圈是固定在柱塞桿上防止泵腔內(nèi)的液體泄漏同時，是保證泵頭輸液正常的關(guān)鍵部件。但柱塞桿和柱塞密封圈長期使用會發(fā)生磨損效高性，主要與流量模式、操作壓力和所使用的流動相有關(guān)。當使用含鹽的流動相時提升，由于脫水或蒸發(fā)高品質，可能形成鹽結(jié)晶，而泵運動時鹽結(jié)晶會導(dǎo)致密封圈和柱塞桿的磨損的特點。因此健康發展，每天實驗前和實驗后都需用純水沖洗一次密封圈(在柱塞密封圈和二級密封圈之間)有效保障，保持清洗管內(nèi)有水以防止形成晶體，延長柱塞桿和密封圈的使用壽命長效機製。
在線過濾器：為了防止由于流動相雜質(zhì)微粒進入色譜系統(tǒng)講實踐，泵在放空閥內(nèi)安裝了在線過濾器，經(jīng)泵出口流出的液體通過在線過濾器營造一處，經(jīng)排空管流出的液體不通過在線過濾器改革創新。儀器使用一定時間后，建議用戶清洗在線過濾器的燒結(jié)不銹鋼過濾片取得顯著成效。用扳手卸下壓帽新模式，將密封環(huán)和燒結(jié)不銹鋼過濾片一同取出清洗，清洗后按原位裝上不容忽視。清洗溶劑可以選擇30%稀硝酸溶液組織了，正相系統(tǒng)需注意濾頭的烘干處理。
3說服力、分離系統(tǒng)
分離系統(tǒng)包括色譜柱搶抓機遇、保護柱以及柱溫箱。
色譜柱：色譜柱是樣品分離的核心表示。色譜柱在使用前必須仔細閱讀說明書全面闡釋，了解色譜柱使用的pH值范圍、溶劑耐受范圍競爭力所在、壓力范圍和維護方法等事項引人註目。色譜柱使用完后，需及時對色譜柱進行沖洗溝通機製。沖洗完成后好宣講，應(yīng)該將色譜柱從儀器上拆下來，兩端用廠家配的堵頭密封后領先水平，保存在色譜柱盒里新產品。
保護柱：保護柱的作用主要是防止吸附性強的雜質(zhì)對色譜柱污染，從而延長色譜柱的壽命橋梁作用。針對不同型號的色譜柱，應(yīng)選擇相對應(yīng)填料的保護柱求索。應(yīng)注意柱芯也是有壽命的讓人糾結，應(yīng)該定期進行更換。
柱溫箱：色譜柱溫度變化穩定發展，可能會導(dǎo)致保留時間的變化基石之一。為了避免這個問題，建議使用柱溫箱增持能力。
4共同努力、檢測系統(tǒng)
液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器行業內卷、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
(1)紫外檢測器
該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測新的動力。其特點是的過程中，使用面廣(如蛋白質(zhì)、核酸廣泛關註、氨基酸促進進步、核苷酸、多肽優勢領先、激素等均可使用)迎來新的篇章、靈敏度高(檢測下限為10-10g/ml)、線性范圍寬推動並實現、對溫度和流速變化不敏感薄弱點、可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
(2)示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分優化程度，均可使用示差折光檢測器檢測積極性。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統(tǒng)取得明顯成效。這一系統(tǒng)通用性強約定管轄、操作簡單，但靈敏度低(檢測下限為10-7g/ml)創新的技術，流動相的變化會引起折光率的變化發揮，因此，它既不適用于痕量分析快速增長，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測開放以來。
(3)熒光檢測器
凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下高質量，其發(fā)射光的熒光強度與物質(zhì)的濃度成正比提供了有力支撐。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物(如多環(huán)芳烴前景、氨基酸進一步意見、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等)的測定共享應用，其靈敏度很高(檢測下限為10-12～10-14g/ml)生產能力，痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測均可采用。
HPLC常用的檢測器是紫外檢測器示範推廣。在日常使用過程中紫外檢測器主要需要注意檢測池和氘燈的使用與維護處理方法。
檢測池：檢測池長時間使用可能會造成污染，如果儀器的參比能量(REF ENERGY)正常持續向好，測量能量(SMPENERGY)偏低習慣，可能為檢測池污染導(dǎo)致充足，可以對檢測池進行清洗。對檢測池零件的進行清洗的積極性，一般先采用約1：4的硝酸溶液超聲清洗綠色化發展，分別用純水和甲醇溶液清洗，然后重新組裝并將檢測池池體推進池腔內(nèi)十大行動，擰緊池板螺絲左右。注意組裝中，池玻璃及墊片一定要放正綜合措施，以免壓碎池玻璃可靠保障，造成檢測池泄漏。
氘燈：氘燈正常使用壽命可在1500小時以上設計標準。燈的使用壽命與檢測器的使用時間和開啟頻率有關(guān)開展，因此使用過程中應(yīng)盡量節(jié)省不必要的開機時間，減少開關(guān)頻率發揮重要帶動作用，以延長氘燈的使用壽命意向。如果準確地判斷出氘燈已經(jīng)不能點亮或能量太低，則需要更換新的氘燈文化價值。在購買氘燈時形式，應(yīng)注意咨詢和核對氘燈的型號與儀器型號是否匹配。更換到氘燈時不斷完善，參照儀器說明書中的相關(guān)內(nèi)容數字化，特別要注意氘燈連接線的位置順序。
5基礎上、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進行采集各領域、貯存、顯示保持競爭優勢、打印和處理等操作進行培訓，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展長效機製。
色譜法的常用基本術(shù)語
1法治力量、色譜圖(chromatogram)：色譜柱流出物通過檢測器系統(tǒng)時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間或流動相流出體積的曲線圖，或者通過適當?shù)姆椒ㄓ^察到的紙色譜或薄層色譜斑點改造層面、譜帶的分布圖紮實。
2、(色譜)峰(chromatographic peak)：色譜柱流出組分通過檢測器系統(tǒng)時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的微分曲線新體系。
3、峰底(peak base)：峰的起點與終點之間的連接的直線創造。
4不難發現、峰高(h 貢獻法治，peak height)：色譜峰大值點到峰底的距離。
5發展需要、峰寬(W 攻堅克難，peak width)：在峰兩側(cè)拐點處所作切線與峰底相交兩點的距離。
6顯示、半高峰寬(W h/2 雙向互動，peak withd at half height)：通過峰高的中點作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點之間的距離設計能力。
7品牌、峰面積(A ，peak area)：峰與峰底之間的面積更為一致。
8等形式、拖尾峰(tailing peak)：后沿較前沿平緩的不對稱的峰。
9研究與應用、前伸峰(leading peak)：前沿較后沿平緩的不對稱的峰飛躍。(又叫伸舌峰、前延峰)
10全面協議、假峰(ghost peak)：除組分正常產(chǎn)生的色譜峰外重要部署，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現(xiàn)的色譜峰，即并非由試樣所產(chǎn)生的峰工具。這種色譜峰并不代表具體某一組分智慧與合力，容易給定性、定量帶來誤差廣泛關註。(又叫鬼峰)
11促進進步、畸峰(distrorted peak)：形狀不對稱的色譜峰，前伸峰優勢領先、拖尾峰都屬于這類迎來新的篇章。
12、反峰(negative peak)：也稱倒峰不可缺少、負峰蓬勃發展，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。
13積極回應、原點(origin)：紙或薄層板上滴加試樣部位的中心點重要性。
14、區(qū)帶拖尾(zone tailing)：由于物理多種場景、化學(xué)等作用的影響多元化服務體系，一種組分在展開后形成的彗星形狀斑點。
15、基線(base line)：在正常操作條件下深度，僅有流動相通過檢測器系統(tǒng)時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號曲線帶動擴大。
16、基線漂移(baseline drift)：基線隨時間定向的緩慢變化開拓創新。
17持續發展、基線噪聲(N ，baseline noise)：由于各種原因而引起的基線波動促進善治。
應(yīng)用領(lǐng)域
環(huán)境：常見無機陰陽離子擴大、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯發揮效力、硝基化合物新格局、有害重金屬及其形態(tài)、除草劑服務水平、 農(nóng)藥最新、酸沉降成分。
農(nóng)業(yè)：土壤礦物成分處理方法、肥料重要作用、飼料添加劑、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中無機和有機成分習慣。
石油：烴類族組成充足、石油中微量成分。
化工：無機化工產(chǎn)品的積極性、合成高分子化合物綠色化發展、表面活性劑、洗滌劑成分不久前、化妝品效果、染料。
材料：液晶材料合規意識、合成高分子材料密度增加。
食品：無機陰陽離子、有機酸創新內容、氨基酸機遇與挑戰、糖、維生素善於監督、脂肪酸集成技術、香料、甜味劑更合理、防腐劑適應能力、人工色素更優美、病原微生物、霉菌毒素防控、多核芳烴合作關系。
生物：氨基酸、多肽深刻內涵、蛋白質(zhì)、核糖核酸融合、生物胺深入闡釋、多糖、酶完成的事情、天然高分子化合物物聯與互聯。
醫(yī)藥：人體化學(xué)成分、各類合成藥物成分改造層面、各種天然植物和動物藥物化學(xué)成分供給。
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2025第十屆華南空氣壓縮機展覽會
展會城市：佛山市展會時間：2025-05-21