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光片熒光顯微鏡

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diSPIM是一種靈活和易于使用的實(shí)施選擇性平面照明顯微鏡(的SPIM),允許雙視圖(d樣品的)流程,而安裝在一個(gè)倒置顯微鏡上(即SPIM的物鏡是直立)合作。diSPIM由NIH / NIBIB和應(yīng)用科學(xué)儀器(ASI)的Hari Shroff實(shí)驗(yàn)室共同開(kāi)發(fā)。SPIM也稱為光片熒光顯微鏡或LSFM助力各業,因?yàn)樗褂霉馄蚬馄矫娲怪庇诔上穹较蛘樟翗悠贰?

什么是SPIM或LSFM極致用戶體驗?

選擇性平面照明顯微鏡(SPIM)是一種快速而柔和的成像技術(shù),將寬視野成像的速度與適度的光學(xué)切片和低的光漂白結(jié)合在一起應用。它已成為重要的熒光成像方式建議,尤其是對(duì)于體積成像。SPIM也稱為光片熒光顯微鏡(LSFM)或簡(jiǎn)稱為“光片”相貫通。 SPIM或LSFM的定義特征是從側(cè)面對(duì)焦平面進(jìn)行平面照明不斷發展。在任何給定時(shí)間僅照亮樣品的一小部分,從而使光損傷小化自動化方案,并且提供光學(xué)切片緊密協作,與寬視野落射熒光相比,可以提高SNR線上線下。由于以廣角(二維平行)方式收集圖像發揮重要作用,因此,光片成像比點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡要快得多講故事,點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡一次只能檢測(cè)一個(gè)像素。
光學(xué)薄片顯微鏡由于以下三個(gè)關(guān)鍵特性而迅速在體積成像中獲得普及:首先性能穩定,由于將激發(fā)限制在焦平面附近全面革新,因此光損傷小化作用,例如,生物存活的時(shí)間更長(zhǎng)行業分類。第二技術特點,獲得良好的光學(xué)切片,通常接近共聚焦顯微鏡發展邏輯。第三凝聚力量,采集速度非常快聽得進,比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡快幾個(gè)數(shù)量級(jí)新的力量。 SPIM的主要缺點(diǎn)是,需要額外的光學(xué)器件來(lái)生成光片便利性。見(jiàn)的是全面展示,將一個(gè)單獨(dú)的照明物鏡與檢測(cè)物鏡正交放置,并將產(chǎn)生紙張的光學(xué)器件放置在該照明物鏡和激光源之間深刻認識。添加額外的鏡頭會(huì)給成像系統(tǒng)和樣品安裝帶來(lái)空間限制核心技術。從本質(zhì)上講,顯微鏡需要圍繞樣品進(jìn)行設(shè)計(jì)主動性,因此存在各種各樣的光片顯微鏡設(shè)計(jì)創造性,每種設(shè)計(jì)都不同的樣品和不同的安裝要求。相比之下道路,傳統(tǒng)的共聚焦或落射熒光顯微鏡只有一條光路規模設備,可以容納更多種類的樣品。換句話說(shuō)責任製,SPIM的優(yōu)點(diǎn)是以任何單個(gè)工具的適用范圍更窄為代價(jià)的十分落實。

方案

將兩個(gè)物鏡以直角放置在水平安裝在開(kāi)放式培養(yǎng)皿中的樣品上方,每個(gè)物鏡與垂直方向成45度角規則製定。從一個(gè)物鏡創(chuàng)建一個(gè)光片製造業,并使用另一個(gè)物鏡對(duì)其進(jìn)行成像。通過(guò)將光片移動(dòng)通過(guò)樣品來(lái)收集一堆圖像關規定。對(duì)于某些應(yīng)用程序發展基礎,單個(gè)視圖或堆棧中的3D信息就足夠了(iSPIM)。對(duì)于雙視圖系統(tǒng)迎難而上,兩個(gè)物鏡的作用相反積極,以從垂直方向收集另一個(gè)堆棧,然后可以將兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行計(jì)算合并以生成具有各向同性分辨率的3D數(shù)據(jù)集(克服了通常的軸向分辨率差的問(wèn)題從其他視圖獲取信息)堅持先行。因此產業,雙視圖diSPIM具有兩條(通常是對(duì)稱的)光路,包括兩個(gè)掃描儀和兩個(gè)攝像頭情況較常見。
diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上可持續,包括ASI的RAMM框架主要抓手。diSPIM系統(tǒng)可以從各種系統(tǒng)集成商處獲得。各種開(kāi)源和專有軟件包可用于數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理構建。不論所使用的系統(tǒng)集成商和軟件如何創新科技,大多數(shù)底層顯微鏡硬件都是相同的。
diSPIM目標(biāo)的選擇是有限的共創輝煌,因?yàn)樗鼈儽仨毠餐劢苟换ハ嗯鲎簿哂兄匾饬x。diSPI物鏡是40倍水浸物鏡,NA為0.8(Nikon CFI Apo 40XW NIR)大部分。奧林巴斯20x / 0.5物鏡是另一種可能性1)尼康10x / 0.3強大的功能。ASI和Special Optics共同開(kāi)發(fā)了一種適用于diSPIM的透明組織物鏡,該物鏡可以以平板形式或在12 mm球形包膜中對(duì)高達(dá)5 mm深的透明組織進(jìn)行成像解決。單面系統(tǒng)(iSPIM)具有更大的靈活性預期,因?yàn)檎彰魑镧R可以是低NA長(zhǎng)WD物鏡。 sCMOS于SPIM成像幅度。配備了Hamamatsu Flash4結構,Andor Zyla,PCO Edge和Photometrics Prime 95B相機(jī)的diSPIM系統(tǒng)貢獻。 ASI制造了緊湊的光纖耦合2D振鏡或“掃描儀”規模最大,它是系統(tǒng)的組成部分。掃描儀的原始版本通過(guò)在一個(gè)軸上進(jìn)行快速掃描來(lái)創(chuàng)建光片統籌,并使用另一個(gè)軸將光片移動(dòng)通過(guò)樣品2)最深厚的底氣。還提供帶有圓柱透鏡的掃描儀版本,用于產(chǎn)生靜態(tài)光片振奮起來。激發(fā)激光(或激光發(fā)射)的輸出被簡(jiǎn)單地饋送到掃描儀中品質。使用2×1光學(xué)開(kāi)關(guān)或雙輸出激光發(fā)射非常有幫助,這樣激發(fā)就可以全部引導(dǎo)到有源光路中的掃描儀深入各系統。
對(duì)于需要環(huán)境控制的應(yīng)用開展攻關合作,diSPIM可以輕松地配備恒溫箱外殼和適當(dāng)?shù)脑O(shè)備,以保持樣品的存活和快樂(lè)預下達。 底部物鏡(倒置顯微鏡)通常具有較低的放大倍率物鏡和較便宜的用于定位樣品的照相機(jī)的有效手段。可以輕松添加落射照明方案。

優(yōu)勢(shì)

像其他光片技術(shù)一樣關鍵技術,diSPIM僅照亮聚焦平面,因此是使活細(xì)胞和生物成像的理想選擇深入,因?yàn)樗販p少了光漂白和光毒性效應(yīng)技術研究。與傳統(tǒng)或旋轉(zhuǎn)盤(pán)共焦系統(tǒng)相比,軸向分辨率提高了約2倍開展研究,光漂白減少了10倍以上姿勢,速度可與旋轉(zhuǎn)盤(pán)媲美和諧共生。查看與confocal的更詳細(xì)的比較。 與許多其他光片實(shí)現(xiàn)相比適應性強,diSPIM的主要優(yōu)勢(shì)在于,與倒置顯微鏡類似先進的解決方案,樣品的安裝非常簡(jiǎn)單拓展。見(jiàn)的是,將標(biāo)本放在24 x 50 mm的蓋玻片上宣講活動,蓋玻片固定在一個(gè)特殊的腔室中不斷進步,該腔室可容納浸漬介質(zhì)。具有開(kāi)放式安裝的其他燈片實(shí)現(xiàn)不具有各向同性分辨率效率。查看光片法的更詳細(xì)比較規模。 除了方便定位樣品外,底部物鏡還可用于光操縱(包括光遺傳學(xué))或其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)講道理。它也可以用來(lái)提供樣本的第三張獨(dú)立視圖發展目標奮鬥。這種靈活性也是diSPIM的*優(yōu)勢(shì)。 diSPIM是一種模塊化顯微鏡更多的合作機會,因此可以根據(jù)您的特定需求進(jìn)行多種變化和添加延伸。NIH研究人員,Applied Scientific Instrumentation等正在探索各種新功能和改進(jìn)服務好。請(qǐng)參閱部分變體列表新趨勢。 diSPIM系統(tǒng)可從多個(gè)系統(tǒng)集成商處購(gòu)買。與其他商用輕型薄板解決方案相比共謀發展,它們便宜且靈活數字技術。與定制的SPIM / LSFM系統(tǒng)相比,它們易于獲取市場開拓,使用和維護(hù)措施。另請(qǐng)參見(jiàn)SPIM技術(shù)的更完整的技術(shù)比較。

配置

ASI提供了所有必要的硬件來(lái)實(shí)現(xiàn)diSPIM各項要求,這是一種靈活且易于使用的選擇性平面照明顯微鏡(SPIM)實(shí)現(xiàn)更高要求,可在安裝在倒置(i)上的情況下實(shí)現(xiàn)樣品的雙視圖(d)。顯微鏡新技術。diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上共同學習,包括ASI的RAMM框架。 ASI制造光機(jī)械元件深入,包括電動(dòng)平臺(tái)效高,用于創(chuàng)建和移動(dòng)光片的2D振鏡,以及壓電物鏡移動(dòng)器基礎。需要物鏡性能,激光和照相機(jī)來(lái)完成系統(tǒng)多種方式;用戶可以自己購(gòu)買其他物品,使用出售diSPIM的各種系統(tǒng)集成商的服務(wù)技術創新,或通過(guò)ASI購(gòu)買它們深入交流研討。 diSPIM已在蓋玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞,嵌入在學(xué)院凝膠上的細(xì)胞c上成功進(jìn)行了測(cè)試廣泛應用。線蟲(chóng)和斑馬魚(yú)的胚胎關註度,以及許多其他樣本。

單面系統(tǒng)(iSPIM)

從一個(gè)物鏡創(chuàng)建并使用另一物鏡成像的光片哪些領域。通常通過(guò)使用掃描儀(galvo)移動(dòng)光片敢於挑戰,使光片穿過(guò)樣品,該掃描器與移動(dòng)成像物鏡的壓電平臺(tái)同步建立和完善。
  • 優(yōu)勢(shì):的購(gòu)置提供了遵循,的,直接的設(shè)置大型。
  • 缺點(diǎn): XY分辨率優(yōu)于Z分辨率服務效率。
  • 雙面系統(tǒng)(diSPIM)

    雙方都有光片掃描儀,壓電物鏡定位器和相機(jī)重要意義。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中主要抓手,從兩個(gè)視圖中都收集了一堆圖像,并且可以將兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行計(jì)算合并以生成具有各向同性分辨率的3D數(shù)據(jù)集(另一個(gè)視圖中的信息克服了通常的軸向分辨率差的問(wèn)題)服務。如果需要很重要,可以單面模式運(yùn)行。
  • 優(yōu)勢(shì):XY和Z分辨率都非常好–結(jié)合了速度和分辨率覆蓋,這是活細(xì)胞成像所*的異常狀況。
  • 缺點(diǎn):需要購(gòu)買更多的硬件。各向同性分辨率所需的數(shù)據(jù)后處理高效。

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