自噬是近年來很熱門的領(lǐng)域求索，很多人傻傻分不清自噬和死亡提供了有力支撐。

 自噬的過程——從一張圖開始

 步驟 1：細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號后鍛造，在胞漿的某處形成一個小的類似「脂質(zhì)體」樣的膜結(jié)構(gòu)，然后不斷擴張，但它并不呈球形系統，而是扁平的非常重要，就像一個由 2 層脂雙層組成的碗，可在電鏡下觀察到空間廣闊，被稱為 Phagophore營造一處，是自噬發(fā)生的鐵證之一。

 步驟 2： Phagophore 不斷延伸知識和技能，將胞漿中的任何成分取得顯著成效，包括細(xì)胞器，全部攬入「碗」中特征更加明顯，然后「收口」估算，成為密閉的球狀的「自噬體」講理論，即 autophagosome的可能性。電鏡下觀察到自噬體是自噬發(fā)生的鐵證之二。有 2 個特征：一是雙層膜服務為一體，二是內(nèi)含胞漿成分問題，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等全會精神。

 步驟  3：自噬體形成后系統穩定性，可與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡和內(nèi)體融合（加了個「可」字集中展示，意思是這種情況不是必然要發(fā)生的）實力增強。

 步驟 4：自噬體與溶酶體融合形成 autolysosome，期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解探索創新，二者的內(nèi)容物合為一體帶來全新智能，自噬體中的「貨物」也被降解，產(chǎn)物（氨基酸新產品、脂肪酸等）被輸送到胞漿中新型儲能，供細(xì)胞重新利用，而殘渣或被排出細(xì)胞外或滯留在胞漿中新品技。

自噬的研究方法

正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低範圍，不適于觀察，因此紮實做，必須對自噬進行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)空間廣闊，經(jīng)報道的工具藥有：

1.  自噬誘導(dǎo)劑

Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即 Inositol monophosphatase提供深度撮合服務，肌醇單磷酸酶）

Earle's *：制造饑餓

N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway 抑制劑

Rapamycin：mTOR 抑制劑

Xestospongin B/C：IP3R 阻滯劑

2.  自噬抑制劑 

3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制劑

Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑

Hydroxychloroquine（*）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）

除了選用上述工具藥外服務品質，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對自噬相關(guān)基因進行干預(yù)：包括反義 RNA 干擾技術(shù)（Knockdown）、突變株篩選、外源基因?qū)氲取?/p>

自噬的觀察與檢測

細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后表現明顯更佳，需對自噬過程進行觀察和檢測狀態，常用的策略和技術(shù)有：

1. 觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到指導，因此廣泛認同，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore 的特征為：新月狀或杯狀流動性，雙層或多層膜鍛造，有包繞胞漿成分的趨勢。

自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)持續創新，內(nèi)含胞漿成分改善，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)協調機製、核糖體等信息化。

自噬溶酶體（AV2）的特征為：單層膜，胞漿成分已降解實踐者。（autophagic vacuole取得明顯成效，AV）

2. 在熒光顯微鏡下采用 GFP-LC3 融合蛋白來示蹤自噬形成

由于電鏡耗時長，不利于監(jiān)測（Monitoring）自噬形成數據，人們利用 LC3 在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)創新的技術。無自噬時，GFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿中顯著；自噬形成時快速增長，GFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點性能，一個斑點相當(dāng)于一個自噬體初步建立，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。

3. 利用 Western Blot 檢測 LC3-II/I 比值的變化以評價自噬形成

自噬形成時組建，胞漿型 LC3（即 LC3-I）會酶解掉一小段多肽各有優勢，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即 LC3-II），因此重要的意義，LC3-II/I 比值的大小可估計自噬水平的高低持續。

LC3 抗體對 LC3-II 有更高的親和力，會造成假陽性再獲。方法 2 和 3 需結(jié)合使用產品和服務，同時需考慮溶酶體活性的影響。

4.  MDC 染色

MDC 染色即 Monodansylcadaverine體驗區，單丹磺酰尸胺染色增多，包括自噬體活動上，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的進一步推進。

5. CellTrackerTM Green 染色

主要用于雙染色導向作用，但其能染所有的液泡滿意度，故也屬于非特異性的具體而言。

自噬相關(guān)蛋白定位

在研究自噬相關(guān)蛋白時，需對其進行定位服務品質。由于自噬體與溶酶體背景下、線粒體綜合措施、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關(guān)系密切自然條件，為了區(qū)別設計標準，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：

Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合互動互補。
LysoTrackerTM 探針：有紅或藍色可選發揮重要帶動作用，顯示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：載體成就，轉(zhuǎn)染后表達一個融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號）重要方式，可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）開展面對面。
MitoTraker 探針：特異性顯示活的線粒體系統，熒光在經(jīng)過固定后還能保留。
Hsp60：定位與線粒體基質(zhì)連日來，細(xì)胞死亡時不會被釋放快速融入。
Calreticulin（鈣網(wǎng)織蛋白）：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。

Note：這些蛋白均為胞漿蛋白系統，爬片或*消化的細(xì)胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize）增強，可采用 0.1% SDS 處理。