染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation實際需求，ChIP）是一種用于研究目的蛋白在染色質(zhì)上定位的技術(shù)。ChIP 的原理是通過(guò)甲醛處理細(xì)胞固定 DNA 和蛋白優勢，然后提取染色質(zhì)善謀新篇，使用超聲或酶解將染色質(zhì)剪切成小片段。

之后使用結(jié)合在染色質(zhì)的目的蛋白或組蛋白修飾特異性抗體富集 DNA 片段提供堅實支撐。富集的 DNA 片段可以通過(guò) PCR還不大，DNA 芯片或測(cè)序進(jìn)行分析。雖然原理看起來(lái)很簡(jiǎn)單信息化技術，但 ChIP 是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)的技術(shù)發揮作用，很多因素都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

如何選擇 ChIP 抗體逐步顯現？

抗體的質(zhì)量是 ChIP 成功非常關(guān)鍵的因素銘記囑托，只有能夠識(shí)別染色質(zhì)狀態(tài)下的天然蛋白構(gòu)象的高質(zhì)量的抗體才能用于 ChIP 實(shí)驗(yàn)引領。

想要知道一個(gè)抗體是否適合用于 ChIP 實(shí)驗(yàn)其實(shí)很簡(jiǎn)單。正規(guī)廠家的說(shuō)明書(shū)都會(huì)有一項(xiàng)是說(shuō)明應(yīng)用范圍的示範。挑選抗體時(shí)優(yōu)先選擇應(yīng)用范圍有「ChIP」并有相關(guān)數(shù)據(jù)的應用前景，說(shuō)明抗體經(jīng)過(guò)檢測(cè)，可以用于 ChIP運行好。如果找不到這樣的抗體可以?xún)?yōu)先挑選經(jīng)過(guò) IF首次、IP、ICC 驗(yàn)證的部署安排，之后自己進(jìn)行驗(yàn)證或委托外包服務(wù)公司進(jìn)行驗(yàn)證搖籃。

除此之外，在做組蛋白修飾 ChIP 時(shí)了解情況，因?yàn)楦鞣N組蛋白修飾之間差異非常小深入，這對(duì)抗體特異性提出了更高的要求。如果抗體特異性不夠高導(dǎo)致發(fā)生交叉反應(yīng)重要的，很可能產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。針對(duì)這一問(wèn)題姿勢，可以使用包括 384 種不同修飾的組蛋白芯片檢測(cè)自己生產(chǎn)組蛋白抗體特異性相互融合，保證組蛋白抗體的高特異性。

沒(méi)有特異性抗體怎么辦綠色化？

如果目標(biāo)蛋白沒(méi)有商業(yè)化的抗體可選不同需求，一種方式是定制抗體，之后進(jìn)行 ChIP 驗(yàn)證保持穩定。這種方式的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)到的是內(nèi)源性的蛋白總之，結(jié)果反映的一定是體內(nèi)真實(shí)的蛋白和 DNA 相互作用。但定制抗體成本較高支撐作用，并且 ChIP 驗(yàn)證過(guò)程失敗率高達(dá) 75%研學體驗。

另一種方式是給目標(biāo)蛋白加標(biāo)簽，通過(guò)標(biāo)簽檢測(cè)目標(biāo)蛋白效高性。AM-Tag 標(biāo)簽是專(zhuān)門(mén)針對(duì) ChIP 設(shè)計(jì)的蛋白標(biāo)簽模式。通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建加到目標(biāo)蛋白 C 端。轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞之后通過(guò)特異性 AM-tag 抗體進(jìn)行 ChIP提升。Active Motif 實(shí)驗(yàn)室通過(guò)構(gòu)建雌激素受體（ER）加 AM-tag 標(biāo)簽質(zhì)粒檢測(cè) AM-tag ChIP 效果高品質，結(jié)果數(shù)據(jù)與發(fā)表文章中使用 ER 抗體檢測(cè)內(nèi)源性蛋白結(jié)果一致。

沒(méi)有足夠的起始樣本怎么辦支撐能力？

ChIP 是一項(xiàng)富集技術(shù)資源優勢，不是純化方法。大部分我們感興趣的蛋白或組蛋白修飾分布在整個(gè)基因組特征更加明顯，只是不同區(qū)域的富集度不同估算。因此講理論，有意義的結(jié)果需要的富集。

傳統(tǒng)的 ChIP 實(shí)驗(yàn)需要至少兩百萬(wàn)細(xì)胞作為起始材料奮戰不懈，這對(duì)于有些珍貴細(xì)胞樣本是非常困難的市場開拓。解決這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵是通過(guò) ChIP 的 buffer 及條件優(yōu)化，降低非特異性的背景大大縮短，實(shí)現(xiàn)*的信噪比要落實好。

針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，一方面通過(guò) buffer 條件優(yōu)化更默契了，提供高靈敏 ChIP 試劑盒先進技術，zui少可用 1000 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行 ChIP 實(shí)驗(yàn)。另一方面不合理波動，也提供低細(xì)胞量的 ChIP-Seq 服務(wù)宣講手段，對(duì)于高豐度目標(biāo)蛋白（如組蛋白修飾）僅需 10000 個(gè)細(xì)胞；對(duì)于低豐度目標(biāo)蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子）積極拓展新的領域，僅需 50000～500000 個(gè)細(xì)胞配套設備。

如何對(duì) ChIP-seq 進(jìn)行jing確定量？

我們的研究團(tuán)隊(duì)在對(duì)不同樣本的 H3K27me3 ChIP-seq 數(shù)據(jù)比較時(shí)相對開放，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有意思的問(wèn)題推進高水平。通過(guò) H3K27me3 甲基轉(zhuǎn)移酶 EZH2 的抑制劑處理細(xì)胞以后，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明拓展應用，H3K27me3 整體水平顯著下降生產創效。ChIP-qPCR 也檢測(cè)到很多位點(diǎn)的 H3K27me3 水平有明顯下調(diào)。

但用常規(guī)的 ChIP-seq 分析方法比較管理，并不能檢測(cè)到 H3K27me3 水平的下降。造成這個(gè)結(jié)果的原因在于在標(biāo)準(zhǔn)的 ChIP-seq 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，文庫(kù)構(gòu)建需要的 PCR 擴(kuò)增以及常規(guī)數(shù)據(jù)分析時(shí)對(duì)整體數(shù)據(jù)量的校正掩蓋了樣本間數(shù)據(jù)量的差異戰略布局。

針對(duì)這一問(wèn)題事關全面，Active Motif 憑借多年的 ChIP-seq 服務(wù)經(jīng)驗(yàn)成功研發(fā)出「Spike-In」校正策略。標(biāo)準(zhǔn)的 ChIP 反應(yīng)是使用樣本染色質(zhì)和抗體建立的讓人糾結。在「Spike-in」校正體系中規模，果蠅（Dropsophila）「Spike-in」染色質(zhì)和識(shí)別果蠅染色質(zhì)的抗體也被加入到反應(yīng)體系中。因?yàn)楣壍幕蚪M和人的基因組同源性很低基石之一，在做測(cè)序分析的時(shí)候聯動，它就可以作為內(nèi)參，對(duì)整個(gè) ChIP-seq 起到矯正作用共同努力。

如何檢測(cè)染色質(zhì)上蛋白之間的相互作用行業內卷？

RIME（Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins）是一項(xiàng) ChIP 和質(zhì)譜分析相結(jié)合的技術(shù)。非常適合用于鑒定轉(zhuǎn)錄輔助因子和染色質(zhì)相關(guān)蛋白的相互作用逐漸完善。傳統(tǒng)的鑒定蛋白相互作用的方法是 IP 之后進(jìn)行質(zhì)譜分析參與能力。與 IP 方法不同合理需求，RIME 使用的起始材料經(jīng)過(guò)交聯(lián)，主要檢測(cè)的是染色質(zhì)上蛋白之間的相互作用充分發揮。

怎么檢測(cè)同一基因組位置的兩個(gè)蛋白質(zhì)或不同的組蛋白修飾高質量？

當(dāng)進(jìn)行 ChIP 實(shí)驗(yàn)去解碼組蛋白編碼時(shí)，證明兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)或者組蛋白修飾占據(jù)同一個(gè)核小體位點(diǎn)是非常有意義的選擇適用」芾?；蛘撸苍S需要確定一個(gè)蛋白質(zhì)和特定的組蛋白修飾是否在同一個(gè)調(diào)控元件業務指導。

Sequential ChIP（也叫做 Re-ChIP）是一項(xiàng)使用兩個(gè)不同抗體進(jìn)行連續(xù) ChIP 反應(yīng)的技術(shù)改進措施，一次 ChIP 反應(yīng)之后使用特殊 buffer 洗脫沉淀的染色質(zhì)以避免一個(gè)抗體對(duì)后續(xù) ChIP 的影響。之后加入第二個(gè)不同的抗體進(jìn)行 ChIP長足發展。通過(guò)兩個(gè)不同抗體和兩次 ChIP 反應(yīng)今年，得到兩個(gè)蛋白或不同組蛋白修飾所在的同一基因組 DNA 片段。

ChIP 能做 RNA 和蛋白質(zhì)相互作用嗎結構不合理？

有證據(jù)顯示 RNA 導(dǎo)向過(guò)程在介導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和表觀遺傳記憶有重要作用動手能力。從染色質(zhì)中純化的核酸含有 2～5% RNA；這些 RNA 是非編碼的序列意見征詢，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄沉默中有重要作用引領。

然而，因?yàn)槿旧|(zhì)的復(fù)雜度以及染色質(zhì)中大量 DNA 的存在開放以來，用傳統(tǒng)的 ChIP 技術(shù)研究這些 RNA 是很困難的。為了使基因組調(diào)控中 RNA 的功能研究變得可能高質量，我們利用其在 ChIP 的技術(shù)研發(fā)了 RNA-ChIP 的一代試劑盒提供了有力支撐，主要用于研究染色質(zhì)中 RNA-蛋白質(zhì)的相互作用。

RNA-蛋白質(zhì)的相互作用用甲醛固定前景，染色質(zhì)剪切結(jié)合 DNA 酶處理得到了可以用特異性蛋白抗體免疫沉淀的 RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物進一步意見。隨后進(jìn)行解交聯(lián)，解交聯(lián)之后的 RNA 再用 DNA 酶處理確保沒(méi)有 DNA 污染共享應用。