蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot持續。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法再獲。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色產品和服務。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。

western blot蛋白和組織樣本-80度保存體驗區，干冰運(yùn)輸增多。
western blot原理的實(shí)驗(yàn)步驟
1、 細(xì)胞總蛋白提取
1.1 對(duì)于懸浮細(xì)胞: 離心收集細(xì)胞有望，每106細(xì)胞加250 ul  RIPA（在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）進一步推進，振蕩。如果需要提高蛋白濃度方案，可以適當(dāng)減少細(xì)胞總蛋白提取試劑體積應用的選擇。
1.2 對(duì)于貼壁細(xì)胞:
1.2.1 用TBS沖洗細(xì)胞2-3次。zui后一次*吸干殘留液科普活動。
1.2.2 加入適當(dāng)體積的 RIPA（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培養(yǎng)板創新延展、瓶?jī)?nèi)3-5min習慣。期間反復(fù)晃動(dòng)培養(yǎng)板、瓶進展情況，使試劑與細(xì)胞充分接觸。
1.2.3 用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下綠色化發展，收集到1.5ml離心管中至關重要。
1.3 冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打用上了，確保細(xì)胞*裂解提升行動。
1.4 12000g離心5min，收集上清關註，即為總蛋白溶液研究進展。
2、 組織蛋白提冗B日來。?br />2.1 組織塊用冷TBS洗滌2-3次快速融入，去除血污，剪成小塊置于勻漿器系統。加入10倍組織體積本試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）冰上*勻漿增強。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積交流等。
2.2 將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中更加廣闊，振蕩。冰浴30min提高，期間用移液器反復(fù)吹打可以使用，確保細(xì)胞*裂解。
2.3 12000g離心5min紮實，收集上清效高化，即為總蛋白溶液。
3進行培訓、 蛋白濃度測(cè)定：BCA法側(cè)蛋白濃度
4發展機遇、 SDS-PAGE電泳
4.1 清洗玻璃板
4.2 灌膠與上樣
4.2.1 將玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊法治力量，以免漏膠全技術方案。
4.2.2 按實(shí)驗(yàn)安排配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠供給。大約45min后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干優勢與挑戰。
4.2.3 按前面方法配5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠解決方案。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中趨勢。
4.3 加足夠的電泳液后上樣電泳有力扭轉。將樣品加入電泳孔中，電泳一站式服務。濃縮膠電壓75V廣度和深度，分離膠用120V。電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳引領作用，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜加強宣傳。
5 轉(zhuǎn)膜  （小于20kd的蛋白請(qǐng)使用0.22um的PVDF膜。）
5.1 準(zhǔn)備6張7×9cm的濾紙和一張大小適中的 PVDF膜用的舒心，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化技術發展。
5.2 在加有轉(zhuǎn)移液的盆里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子，兩塊海綿墊集成，一支玻棒重要手段，濾紙和經(jīng)過(guò)活化的PVDF膜。
5.3 將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平穩定性。在墊子上墊海綿像一棵樹、三層濾紙。
5.4 小心剝下分離膠蓋于濾紙上更高效，將膜蓋于膠上全面協議，并除氣泡。在膜上蓋三張濾紙并除去氣泡具體而言。zui后蓋上另一個(gè)海綿墊工具。
5.5 轉(zhuǎn)膜條件（濕轉(zhuǎn)）
5.5.1 快轉(zhuǎn)。300mA恒流轉(zhuǎn)膜半小時(shí)喜愛，或者200mA轉(zhuǎn)膜1小時(shí)重要的角色，時(shí)間可以略微調(diào)整，時(shí)間對(duì)應(yīng)調(diào)整向好態勢。
5.5.2 慢轉(zhuǎn)平臺建設。轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，25V恒壓轉(zhuǎn)膜過(guò)夜貢獻力量。
6 免疫反應(yīng)
6.1 將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配)重要的作用，封閉1h。
6.2 稀釋一抗（TBST溶解的5%脫脂牛奶去創新，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA）足夠的實力，4℃孵育過(guò)夜（快轉(zhuǎn)），或者4℃孵育抗體3小時(shí)（慢轉(zhuǎn)）結構。
6.3 用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次更適合，每次5min
6.4 將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30min后溝通協調，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次要素配置改革，每次5min
7 化學(xué)發(fā)光 將ECLA和ECLB兩種試劑在離心管中等體積混合體系，將PVDF膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸，1-2min后帶動產業發展，去盡殘液責任製，包好，放入暗匣中曝光倍增效應。zui后用顯影促進善治、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件多樣性。
8 凝膠圖像分析 將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色新格局，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值明顯。

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