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錦鯉皰疹病毒（KHV）熒光 PCR 檢測試劑盒說明書

試劑簡介

錦鯉皰疹病毒（KHV）熒光 PCR 檢測試劑盒主要感染當(dāng)年草魚種和青魚，死亡率可達(dá)

80%以上競爭力。其它淡水鯉科魚調整推進，如鰱魚、鳙魚、鯽魚機製、鯉魚感染后沒有臨床癥狀同期，但可以攜帶病毒到處傳播。該病在水溫高于20℃以上時流行, 25～28℃為流行高峰堅持先行。常見的臨床癥狀為眼突出產業、體色發(fā)黑，口腔情況較常見、鰓蓋和鰭條基部出血可持續。撕開表皮，可見肌肉出現(xiàn)點狀或塊狀出血體製。剖檢腹腔, 可見腸道充血, 肝構建、脾充血或因失血而發(fā)白。病原為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus服務延伸，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員共創輝煌。病毒為直徑70nm的球形顆粒，有雙層衣殼進一步，無囊膜大部分，含有11個片段的雙鏈RNA。根據(jù)片段長度大小分為大（L1實際需求、L2解決方案、L3，大小在4.0kb～3.7kb）善謀新篇、中（M4增產、

M5、M6方法，大小在2.5～2.0kb）行動力、小（S7切實把製度、S8保供、S9、S10協同控製、S11, 大小在1.6～1.0kb) 三組振奮起來。在不同地區(qū)存在抗原性品質、核酸電泳圖譜利用好、對細(xì)胞的敏感性和對魚的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經(jīng)確定的有二個典型的代表株：GCRV-873為湖南株解決問題，能在CO系列、CIK等細(xì)胞中大量增殖并出現(xiàn)CPE，癥狀以內(nèi)臟出血為主；GCRV-9014為湖北株統籌推進，能在CIK方案、CO細(xì)胞中大量增殖，但不產(chǎn)生CPE了解情況，癥狀以肌肉出血為主深入。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%。

為了適應(yīng)草魚出血仓匾?。℅CRV）快速檢測和疫病研究的需要開展研究，本公司嚴(yán)格依據(jù)SN/T3584-2013草魚出血病檢疫技術(shù)規(guī)范規(guī)定的檢測GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，在本公司嚴(yán)謹(jǐn)?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下生產(chǎn)和質(zhì)檢相互融合。確保本試劑盒滿足標(biāo)準(zhǔn)的檢測要求首要任務。本試劑盒具有快速靈敏、特異不同需求、準(zhǔn)確發展、安全、操作簡單總之、應(yīng)用廣泛等特點及優(yōu)點面向。

2、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴(kuò)增試劑研學體驗。具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

*： 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應(yīng)液

酶混合物陰性對照

GCRV-9014 陽性對照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

錦鯉皰疹病毒（KHV）熒光 PCR 檢測試劑盒取新鮮魚類組織臟器（肝效率、腦、脾近年來、腎）2g 于已洗凈講道理、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS 混勻技術先進，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用更多的合作機會。或取有可疑細(xì)胞病變的細(xì)胞懸液用于檢測認為。

存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h服務好；-70 ℃以下可*保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融 3 次）反應能力。

運輸：采用冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運輸共謀發展。

4、一步法 RT-PCR 檢測

操作方法

樣本的處理（在樣本制備區(qū)進(jìn)行）：

取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管結構重塑，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照市場開拓、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記大大縮短。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板要落實好，無需提取核酸)

每管加入 600 ?L 裂解液緊密相關，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L，一份樣本換用一個吸頭先進技術，再加入 200 ?L 氯仿培訓，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層宣講手段，也可以用手顛倒混勻）重要工具，于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。

取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管配套設備，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預(yù)冷）性能， 做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中對外開放，上清液應(yīng)至少吸取 500?L技術創新，不能吸出中間層，顛倒混勻資料。

于 4 ℃廣泛應用、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清橫向協同，倒置于吸水紙上哪些領域，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 ?L 75％ 乙醇不斷創新，顛倒洗滌建立和完善。

于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）參與水平，小心倒去上清大型，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）明確相關要求。

4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）重要意義，將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清深化涉外，用微量加樣器將其吸干體系，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面參與能力，室溫干燥 3 min合理需求，不能過于干燥，以免 RNA 不溶充分發揮。

加入 11 ?L DEPC 水高質量，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA提高，2 000 r/min 離心 5 s機構，冰上保存?zhèn)溆谩Ｗⅲ禾崛〉?RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增交流；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)基礎。

、試劑準(zhǔn)備

錦鯉皰疹病毒（KHV）熒光 PCR 檢測試劑盒擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：

從試劑盒中取出相應(yīng)的一步法RT-PCR反應(yīng)液還不大、RT-PCR混合酶高產，在室溫下融化后，2 000 r/min 離心5 s發揮作用。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測總數(shù)為n良好，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和銘記囑托，每個樣品測試反應(yīng)體系配制見下表2引領。

提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)示範。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用應用前景，更方便快捷提取核酸】。

根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量運行好，加入到適當(dāng)體積試管中首次，充分混合均勻，向每個一步法RT-PCR管中各分裝15 μL部署安排，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)搖籃。

加樣（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）：

在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋緊管蓋推廣開來，500 r/min離心30s推動。

、檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）：

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內(nèi)資源配置，記錄樣本擺放順序開展研究。循環(huán)條件設(shè)置如下： 一階段：42 oC/30 min；

第二階段：94 oC/4 min問題分析；

第三階段：94 oC/1 min, 55 oC/1 min培養，72 oC/1 min, 30個循環(huán)； 第四階段更加完善，72 oC/8 min形式；

第五階段，4 oC 保存支撐作用。

日漸深入、瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽同時，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面互動式宣講。將10μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和相應(yīng)電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔效高性。在電泳時設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h自動化，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時停止提升。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增初預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄不折不扣。

5支撐能力、結(jié)果判定

一步法RT-PCR后陽性對照出現(xiàn)一條320bp的DNA片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶高效利用。

待測樣品在相應(yīng) 320 bp DNA 位置上有帶特征更加明顯，可判陽性。

6講理論、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3’