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不動桿菌屬通用PCR 檢測試劑盒說明書

1緊密協作、試劑盒簡介貨

不動桿菌屬通用PCR 檢測試劑盒主要感染當年草魚種和青魚，死亡率可達80%以上線上線下。其它淡水鯉科魚發揮重要作用，如鰱魚、鳙魚數據顯示、鯽魚高質量、鯉魚感染后沒有臨床癥狀，但可以攜帶病毒到處傳播記得牢。該病在水溫高于20℃以上時流行, 25～28℃為流行高峰智能設備。常見的臨床癥狀為眼突出、體色發(fā)黑蓬勃發展，口腔特點、鰓蓋和鰭條基部出血。撕開表皮重要性，可見肌肉出現(xiàn)點狀或塊狀出血又進了一步。剖檢腹腔, 可見腸道充血, 肝、脾充血或因失血而發(fā)白聽得進。病原為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus新的力量，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員。病毒為直徑70nm的球形顆粒便利性，有雙層衣殼全面展示，無囊膜，含有11個片段的雙鏈RNA深刻認識。根據(jù)片段長度大小分為大（L1核心技術、L2、L3主動性，大小在4.0kb～3.7kb）創造性、中（M4、M5道路、M6規模設備，大小在2.5～2.0kb）、兄笇?。⊿7競爭力、S8、S9進一步完善、S10集聚、S11, 大小在1.6～1.0kb) 三組優化服務策略。在不同地區(qū)存在抗原性、核酸電泳圖譜發展基礎、對細胞的敏感性和對魚的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經(jīng)確定的有二個典型的代表株：GCRV-873為湖南株建強保護，能在CO同期、CIK等細胞中大量增殖并出現(xiàn)CPE，癥狀以內(nèi)臟出血為主使命責任；GCRV-9014為湖北株效果，能在CIK、CO細胞中大量增殖合規意識，但不產(chǎn)生CPE密度增加，癥狀以肌肉出血為主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%創新內容。為了適應草魚出血矙C遇與挑戰。℅CRV）快速檢測和疫病研究的需要，本公司嚴格依據(jù)SN/T3584-2013草魚出血病檢疫技術(shù)規(guī)范規(guī)定的檢測GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標準服務延伸，在本公司嚴謹?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下生產(chǎn)和質(zhì)檢共創輝煌。確保本試劑盒滿足標準的檢測要求。本試劑盒具有快速靈敏進一步、特異大部分、準確、安全實際需求、操作簡單解決方案、應用廣泛等特點及優(yōu)點。

2善謀新篇、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴增試劑增產。具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

*： 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴增試劑： DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應液

酶混合物陰性對照

GCRV-9014 陽性對照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

（注：*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）

3、樣本采集,存放及運輸

4方法、樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干貢獻。

取新鮮魚類組織臟器（肝、腦穩中求進、脾統籌、腎）2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨協同控製，加 5ml PBS 混勻振奮起來，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用±煤?；蛉∮锌梢杉毎∽兊募毎麘乙河糜跈z測深入各系統。

存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應不超過 24 h解決問題；-70 ℃以下可*保存，但應避免反復凍融（多凍融 3 次）作用。

運輸：采用冰hu或泡沫箱加冰密封進行運輸相互配合。

4、一步法 RT-PCR 檢測

不動桿菌屬通用PCR 檢測試劑盒操作方法

樣本的處理（在樣本制備區(qū)進行）：

取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管著力增加，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照智能化、陰性對照在試劑盒中已標出），做標記處理。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板建設，無需提取核酸)

每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L開展研究，一份樣本換用一個吸頭姿勢，再加入 200 ?L 氯仿，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈首要任務，以免產(chǎn)生乳化層綠色化，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min發展。

取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管拓展，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預冷）， 做標記宣講活動。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應的管中不斷進步，上清液應至少吸取 500?L，不能吸出中間層效率，顛倒混勻規模。

于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置）講道理，小心倒去上清發展目標奮鬥，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)更多的合作機會；加入 600 ?L 75％ 乙醇延伸，顛倒洗滌。

于 4 ℃服務好、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置）新趨勢，小心倒去上清，倒置于吸水紙上共謀發展，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）學習。

4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清應用優勢，用微量加樣器將其吸干高質量發展，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面高效節能，室溫干燥 3 min影響力範圍，不能過于干燥，以免 RNA 不溶新創新即將到來。

加入 11 ?L DEPC 水邁出了重要的一步，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA效高，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)溆没A。提取?RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增性能；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用對外開放，更方便快捷提取核酸】技術創新。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)資料。

廣泛應用、試劑準備擴增試劑準備（在反應混合物配制區(qū)進行）：從試劑盒中取出相應的一步法RT-PCR反應液、RT-PCR混合酶橫向協同，在室溫下融化后哪些領域，2 000 r/min 離心5 s。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測總數(shù)為n不斷創新，其中n為被檢樣品建立和完善、陽性對照與陰性對照的和，每個樣品測試反應體系配制見下表2參與水平。

表 2 每個樣品測試反應體系配制表

試劑 RT-PCR 反應液 RT-PCR 混合酶

用量 15 μL 1.0 μL

根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量大型，加入到適當體積試管中，充分混合均勻明確相關要求，向每個一步法RT-PCR管中各分裝15 μL重要意義，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

加樣（在樣本處理區(qū)進行）：

在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL深化涉外，蓋緊管蓋體系，500 r/min離心30s。

檢測（在檢測區(qū)進行）：

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內(nèi)開展試點，記錄樣本擺放順序共創輝煌。循環(huán)條件設(shè)置如下： 第yi 階段：42 oC/30 min；

第二階段：94 oC/4 min；

第三階段：94 oC/1 min, 55 oC/1 min大部分，72 oC/1 min, 30個循環(huán)強大的功能； 第四階段，72 oC/8 min解決方案；

第五階段優勢，4 oC 保存。

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板基礎。將平板放入水平電泳槽提供堅實支撐，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將10μL樣品PCR擴增產(chǎn)物和相應電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔高產。在電泳時設(shè)立DNA標準分子量作對照信息化技術。5 V/cm電泳約0.5 h，當溴酚藍到達底部時停止良好。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增初預期的特異性DNA電泳帶逐步顯現，拍攝并記錄。

5引領、不動桿菌屬通用PCR 檢測試劑盒結(jié)果判定

一步法RT-PCR后陽性對照出現(xiàn)一條320bp的DNA片段自動化裝置。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。

待測樣品在相應 320 bp DNA 位置上有帶應用前景，可判陽性有很大提升空間。

6、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3