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摘要 　目的: 探討 NR2B2p ERK 2p Elk21 途徑是否參與了大鼠各學習記憶相關腦區(qū) Y 2迷宮逃避性學習和記憶提供堅實支撐。方

法: 健康雄性成年 SD 大鼠 45 只 ,共分為 4 組: ①ifenprodil 腹腔注射組（ifenprodil ip ,14 只） , ②DMSO 腹腔注射組

（DMSO ip ,15只） ; ③ ifenprodil腦室注射組（ifenprodil ic ,8只） ; ④ DMSO腦室注射組（DMSO ic ,8 只） 。以 Y迷宮訓

練和測試成績作為行為學評定指標 ,用免疫組織化學和 Western blot 方法觀察大鼠學習記憶相關腦區(qū)p ERK1/ 2 和

p Elk21 的變化高產。結果: Ifenprodil ip 組與 DMSO ip 組動物的 Y迷宮學習成績沒有明顯差異（ P > 0. 05） ,但 ifenprodil

ip 組 Y迷宮記憶成績差于 DMSO ip 組（ P < 0. 05） 信息化技術。腹腔注射 ifenprodil 導致 Y迷宮訓練后各腦區(qū) p ERK1/ 2 和

p Elk 21 表達的普遍下降 ,其中以海馬、邊緣區(qū)良好、杏仁核zui為明顯 ,與 DMSO ip 組相比差異有顯著性（ P < 0. 05） 逐步顯現。

Ifenprodil ic組與 DMSO ic組*次 Y迷宮測試成績沒有明顯差異（ P > 0. 05） 。*次測試后立即腦室給藥并在

給藥后 6 h測試 Y迷宮記憶再鞏固成績 ,發(fā)現(xiàn)ifenprodil ic組成績下降 ,與 DMSO ic組相比有明顯差異（ P < 0. 05） ,

而且ifenprodil ic組動物各腦區(qū)的p ERK1/ 2和p Elk21 表達與 DMSO ic組相比均普遍下降 ,其中p Elk21 表達在尾殼

核和邊緣區(qū)幾乎*消失引領。結論: NR2B對于大鼠 Y迷宮長期記憶的形成自動化裝置、記憶再鞏固過程是必要的 ,NR2B 的失

活將破壞這些過程。同時 NR2B的失活減弱了 Y迷宮訓練后及記憶再鞏固測試后學習記憶相關腦區(qū)p Elk21 和

p ERK1/ 2表達 ,其中在尾殼核和邊緣區(qū) ,NR2B的失活使記憶再鞏固測試后p Elk21 表達*被阻斷應用前景。

關鍵詞: 　NR2B ; 　 p ERK; 　 p Elk21 ; 　學習和記憶; 　信號轉導; 　大鼠

在神經(jīng)元中 ,胞外信號反應激酶（ext racellular

response kinase ,ERK）途徑在調節(jié)細胞存活和神經(jīng)

元可塑性中起重要作用有很大提升空間。ERK下游靶目標包括突

觸可塑性所必需的轉錄因子 CREB ,Elk21 等。神經(jīng)

元中 ERK活性被多條胞外信號途徑的信號分子所

調節(jié)首次。NMDA 依賴的 ERK蛋白激酶的激活需要包

含有 NR2B 亞基的受體通道的開放和 Ca

2 +

的進入可能性更大。

Ifenprodil 作為一種 NMDA 受體拮抗劑 ,可以

非典型性非競爭性地選擇性結合于NR2B 亞單位的

*結合位點 ,從而選擇性地阻斷含有 NR2B 亞

基的 NMDA 受體的作用。NR2B 亞基特異的 NM2

DA受體抑制劑 ifenprodil 以 3μmol/ L 的濃度即可

抑制培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中 60 %的 NMDAR電流 ,同

時也使 70 % NMDAR 依賴的 ERK 的激活受到抑

制[1 ]

搖籃。本實驗即是通過對大鼠訓練前腹腔注射

ifenprodil 和記憶測試后腦室注射 ifenprodil 來觀察

Y迷宮學習記憶行為的變化并用免疫組織化學和

Western blot 方法觀察ifenprodil 對 Y迷宮訓練后大

鼠各學習記憶相關腦區(qū)p ERK1/ 2 和p Elk21 表達 的

影響 ,以探討 NR2B技術、 p ERK1/ 2推廣開來、 p Elk21 信號通路是

否參與了 Y迷宮行為模式的學習記憶及記憶的再鞏固。

1 　材料與方法

1. 1 　動物

健康雄性成年 SD大鼠 45 只 ,購自*軍醫(yī)大

學實驗動物中心技術研究。體重 200～300 g重要的。保持光照/黑

暗12 h循環(huán)恒定 ,食物由實驗中心提供 ,飲用自來

水。

1. 2 　實驗分組

動物共分為 4 組: （ 1） ifenprodil 腹腔注射組（ifenprodil ip ,14 只） ; （2） ,DMSO 腹腔注射組（DM2

SO ip ,15 只） ,此2 組中分別有7 只動物在訓練后立

即處死 ,用來進行免疫組織化學染色; （3） ifenprodil

腦室注射組（ifenprodil ic ,8 只） ; （4） DMSO 腦室注

射組（DMSO ic ,8 只） ,分別在記憶測試后立即給與

腦室注射姿勢。

1. 3 　手術與給藥

腹腔注射動物在訓練前 15 min 給藥相互融合。將 ifen2

prodil 溶于二甲基亞砜（DMSO）中 ,濃度為 1. 2 mg/ml ,注射量 3 mg/ kg ;DMSO腹腔注射組注射同樣體

積DMSO。

腦室注射組動物在第 2 d 記憶測試后立即經(jīng)腹

腔注射 10 %*（0. 4 ml/ 100 g） ,固定于腦立

體定位儀上 ,雙側腦室鉆孔（坐標:前囟后 1. 6 mm ,

中線兩側 2. 0 mm ,深 3. 5 mm） ,將藥物通過玻璃電

極垂直緩慢注入 ,并留針 10 min綠色化。Ifenprodil 溶于

DMSO中 ,濃度為 2. 0μg/μl ,每側注射 0. 5μl ;DM2

SO腦室注射組注射同樣體積DMSO不同需求。

1. 4 　電 Y迷宮中厭暗逃避反射訓練電 Y型迷宮三條臂的盡頭均有一燈 ,底部是電

網(wǎng) ,實驗時其中有一條臂末端的燈發(fā)出亮光 ,此時該

臂底部電網(wǎng)無電流通過 ,為安全區(qū);另兩臂末端的燈

不亮 ,底部電網(wǎng)通電（約 50～70 V） ,為非安全區(qū)。

安全區(qū)與非安全區(qū)隨機改變保持穩定。每當大鼠到達安全區(qū)

30 s 后再隨機改變安全區(qū)的位置 ,轉變 5 s 后非安

全區(qū)底部電網(wǎng)即有脈沖電流通過 ,刺激正常大鼠足

底而驅使其跑向安全區(qū)總之。大鼠在 10 s 內(nèi)從非安全

區(qū)一次性跑向安全區(qū)即被判為正確 ,否則均判為錯

誤。*天訓練在每只大鼠上重復 60 次 ,記錄正確

次數(shù)支撐作用。少于 25 次視為不合格 ,棄去并及時補充動

物研學體驗。ifenprodil ip 組及其對照 DMSO ip 組在訓練前15 min腹腔注射。訓練結束 24 h 后（第二天）進行

Y迷宮測試 30 次 ,記錄正確次數(shù)效高性。ifenprodil ic 和

DMSO ic組在 Y迷宮測試后立即進行腦室注射 ,并

在 6 h 后測試動物 Y迷宮記憶的再鞏固模式。

1. 5 　免疫組織化學標本取材和染色

腹腔注射組動物進行第二天測試后立即腹腔內(nèi)

注射 10 %*（4 mg/ 100 g）麻醉動物。經(jīng)主

動脈 4 %多聚甲醛灌注固定提升。冠狀冰凍切片 ,厚度

35μm高品質。常規(guī)ABC法染色 ,一抗分別為兔抗單克隆

p ERK1/ 2 抗體（1∶ 200 , Cell Signaling Technology 公

司）和兔抗多克隆p Elk21 抗體（1∶ 100 ,Cell Signaling

Technology 公司） 。采用硫酸鎳銨增強的二氨基聯(lián)

苯胺（ GDN）法顯色支撐能力。陰性對照用正常二抗同源血

清代替一抗 ,其它步驟相同資源優勢。

1. 6 　數(shù)據(jù)的采集

p Elk21 免疫陽性神經(jīng)元使用 scion image 圖像

分析系統(tǒng) ,每只動物每個腦區(qū)選取 5 張切片 ,每張切片選擇一個代表性視野在 200 倍光鏡下檢測平均光

密度。每只動物所選取切片層面基本相同 ,zui后計

算每組大鼠每個腦區(qū) p Elk21 免疫陽性神經(jīng)元平均

光密度特征更加明顯。p ERK1/ 2 免疫陽性細胞計數(shù)在 Olympus顯微鏡 100X 物鏡下進行 ,每只動物所取切片層面

基本相同 ,數(shù)目相同 ,各腦區(qū)均取 5 張連續(xù)切片 ,獲

得該區(qū)陽性神經(jīng)元均數(shù) ,zui后計算每組大鼠每個腦

區(qū)p ERK1/ 2 免疫陽性神經(jīng)元平均數(shù)估算。

1. 7 　Western blot

腦室注射組記憶再鞏固測試后立即斷頸取腦 ,

置干冰上分離嗅球、前額葉數字技術、尾殼核奮戰不懈、邊緣區(qū)、海馬措施、

小腦組織大大縮短。低溫勻漿 , 4 ℃, 10 000 ×g 離心 1 h ,

Bradford法測蛋白濃度 ,變性后 - 80 ℃保存。SDS2

PAGE電泳:8 %分離膠 ,5 %分離膠 ,電泳完畢在半

干電轉儀上將蛋白轉移至硝酸纖維膜上 ,常規(guī)蛋白

免疫印跡染色 ,一抗分別為兔抗 p ERK1/ 2 抗體（1∶

1 000 ,Cell Signaling Technology 公司）及兔抗 p Elk21 抗體（1∶ 1000 ,Cell Signaling Technology 公司） ,zui

后采用硫酸鎳銨增強的二氨基聯(lián)苯胺（ GDN）法顯

色緊密相關。Scion Image圖象處理軟件分析各泳道p ERK1/

2和蛋白條帶光密度（OD）值以及各自的參照泳道

OD值更默契了。計算待檢測泳道 p ERK1/ 2 和 p Elk21 泳道

與各自相應的參照泳道的 OD比值。

1. 8 　統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差（ … x ±s）表示 ,統(tǒng)計分

析軟件采用 SPSS13. 0 ,組間分析采用 one2way

ANOVA。2 　結果

2. 1 　訓練前腹腔注射ifenprodil 對大鼠 Y迷宮學習

及 24 h 后 Y迷宮記憶的影響　　

訓練前 15 min 腹腔注射 ifenprodil 組動物的 Y

迷宮學習成績與 DMSO ip 組相比 ,沒有明顯差異

（ P > 0. 05） ,但是在 24 h 后測試動物的 Y迷宮記

憶 ,ifenprodil ip 組成績差于 DMSO ip 組成績（ P <

0. 05 ,表 1）

Tab. 1 　Effect of ifenprodil peritoneal injection before t raining

on rat Y 2maze memory（ Times , … x ±s）

Group Number

Y 2maze score

Training Test

Ifenprodil ip 7 35. 42 ±5. 74 17. 71 ±2. 69 3

DMSO ip 8 35. 00 ±3. 66 21. 75 ±3. 692.2　 訓練前腹腔注射ifenprodil 對各學習記憶相關腦

區(qū)pERK1/ 2和pElk 21表達的影響

Y迷宮訓練后立即取標本檢測兩組大鼠pERK1/ 2

和pElk 21在各腦區(qū)的表達差異