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5.3.2  大鼠皮膚吹干與凍干比較研究

10年后綜合措施，西北大學的楊維也進行了大鼠皮膚的冷凍干燥實驗。他首先重點研究了濃度自然條件、孵育時間設計標準、孵育溫度對大鼠皮膚凍干保護劑海藻糖負載量的影響。實驗結(jié)果表明互動互補，大鼠皮膚對海藻糖的載入量的優(yōu)化條件為：海藻糖濃度800mmo1/L,孵育溫度37℃發揮重要帶動作用，孵育時間為7h。之后意料之外，皮膚組織分別進行凍干和吹干至關重要。

(1)凍干  皮膚組織在37℃加載海藻糖，4℃加載DMSO效果，將負載了海藻糖和DMS0的皮膚塊放入凍存管內(nèi)有所應，凍存管放入程序凍存盒，置于-80℃冰箱冷凍快速融入。12h后將冷凍的皮膚組織連同凍存管轉(zhuǎn)入預冷的凍干機認為，去掉凍存管蓋子。冷凍干燥機運行狀態(tài)參數(shù)為：冷阱中溫度-45℃增強，冷阱上方溫度0℃左右重要意義，真空度10Pa,凍干時間設置30h。先將皮膚樣品置于冷阱中凍干24h更加廣闊，然后在冷阱上方凍干6h規劃。先在冷阱中凍干是為了防止皮膚組織中固態(tài)的水分回融再結(jié)晶對組織產(chǎn)生冰晶損傷，組織中大部分游離水升華后轉(zhuǎn)冷阱上方凍干，此時溫度稍高可以進一步除去組織內(nèi)部水分進入當下。

(2)吹干  皮膚組織在37℃紮實、800mmol/L海藻糖培養(yǎng)液中孵育7h加載海藻糖，負載了海藻糖的皮膚用濾紙拭去表面殘留液體新體系，表皮朝下平展于玻璃培養(yǎng)皿中投入力度，培養(yǎng)皿敞口置于生物安全柜（打開送風開關）吹干。大鼠皮膚的吹干時間設置為20～30h可以將皮膚中水分去除不難發現，玻璃化狀態(tài)良好貢獻法治。

經(jīng)檢測得知，剛凍干皮膚活性比剛吹干皮膚活性高1/3發展需要，保存時間延長到28d攻堅克難，凍干組皮膚活性與剛吹干組相當。凍干過程中顯示，皮膚組織內(nèi)水分先在DMSO保護下逐漸凍結(jié)雙向互動，放入凍干機后固態(tài)水升華，由于海藻糖取代水分子的作用設計能力，干燥過程組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和活性不會發(fā)生變化品牌，但在吹干過程中皮膚組織內(nèi)水分由液態(tài)直接蒸發(fā)，原來包繞在細胞外的水膜以及和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的水分子可能還未被海藻糖取代就已蒸發(fā)更為一致。上述原因可能導致未保存的凍干皮膚活性高于吹干皮膚紮實做。干燥保存的皮膚活性開始降低速率較快，降到一定程度后降低速率減慢加強宣傳，所以保存一周后凍干組和吹干組皮膚活性沒有統(tǒng)計學差異臺上與臺下。

干燥保存的皮膚置于飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱37℃預水化15min后，皮膚依次用含800mmol/L和400mmol/L海藻糖的DMEM培養(yǎng)液室溫下孵育15min技術發展，用不含海藻糖的無血清DMEM培養(yǎng)液漂洗3次以上集聚效應，清除皮膚組織中殘留的DMSO和海藻糖，最后轉(zhuǎn)入無海藻糖的DMEM培養(yǎng)液中孵育2h重要手段，進行形態(tài)觀察互動講。如圖5-10所示。

凍干皮膚玻璃化狀態(tài)良好像一棵樹，呈半透明狀過程中。復水后能夠恢復到新鮮皮膚的大小和色澤。凍干皮膚角質(zhì)層局部受損能運用，而組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)與新鮮皮膚組織沒有差異達到。將凍干后復水的皮膚移植回自體大鼠，可存活13d不可缺少。

自體移植后凍干組皮膚存活時間較吹干組長蓬勃發展，可能是由于吹干過程對皮膚組織產(chǎn)生的損傷較大特點。凍干組皮膚在6d皮下出現(xiàn)血紅色區(qū)域可能是自體動物在移植皮下發(fā)生血管化，但后來有兩處變成暗紅色重要性，而其他區(qū)域血紅色減弱消失可能是血管化失敗又進了一步，而吹干組未出現(xiàn)血紅色，可能根本就沒有發(fā)生血管化多元化服務體系。

通過HE染色和透射電鏡對比分析新鮮皮膚和干燥皮膚組織結(jié)構(gòu)和細胞結(jié)構(gòu)規劃。HE染色結(jié)果顯示干燥保存過程沒有明顯改變皮膚組織結(jié)構(gòu)，也未影響皮膚組織的結(jié)構(gòu)完整性深度。透射電鏡結(jié)果說明干燥皮膚具有與新鮮皮膚無差別的細胞結(jié)構(gòu)和胞外膠原結(jié)構(gòu)發行速度，同時可觀察到干燥皮膚細胞中結(jié)構(gòu)正常的線粒體和平滑的核膜等細胞器。結(jié)構(gòu)學觀察結(jié)果證明干燥保存未對皮膚組織結(jié)構(gòu)和細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響與時俱進。

通過熒光標記和MTT活性分析研究干燥過程對皮膚活性影響。熒光標記結(jié)果表明初步建立，除毛囊處明顯受損外凍干皮膚組織大部分區(qū)域在水化后能恢復活性綜合運用。MTT活性分析結(jié)果顯示凍干和吹干皮膚仍能分別保持58%和48%的活性。