嘌呤霉素 常用試劑
嘌呤霉素 常用試劑
說明：蛋白質(zhì)合成抑制劑。抑制細菌品率、藻類原生物和哺乳動物細胞生長相貫通。
嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，通過抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽性菌積極影響，各種動物和昆蟲細胞自動化方案。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的類似物越來越重要，能夠與核糖體的A位點結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中線上線下。嘌呤霉素同A位點結(jié)合后，不會參與隨后的任何反應(yīng)醒悟，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽數據顯示。
嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAC），賦予機體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性也逐步提升。這一特性如今普遍應(yīng)用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株記得牢。
嘌呤霉素在細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān)，現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因不可缺少。在某些特定情況下蓬勃發展，嘌呤霉素亦可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。
溶解性：溶于水積極回應，參考濃度50mg/ml重要性。
使用方法
1.建議使用濃度
哺乳動物細胞：1-10 μg/mL，最佳濃度需要殺滅曲線來確定多種場景；
大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌多元化服務體系，使用濃度為125μg/mL。注：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)擴大公共數據，而且受宿主細胞本身的影響深度。
2.溶解方法
用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝于-20℃凍存重要平臺；也可溶于甲醇深刻認識，配制成10 mg/ml的儲存液。
3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)為例）
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型應用提升、生長狀態(tài)主動性、細胞密度創造性、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達的shRNA細胞株道路，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的最丨低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要規模設備。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線（kill curve）。
1） Day 1：24孔板內(nèi)以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板指導，鋪足夠量的孔以進行后續(xù)的梯度實驗競爭力。37℃細胞孵育過夜；
2） Day 2：a）準備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0-15μg/mL進一步完善，至少5個梯度）集聚；b）往孵育過夜后的細胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基；之后37℃孵育細胞調整推進；
3） Day 4：更換新鮮的篩選培養(yǎng)基發展基礎，并觀察細胞存活率。
4） 根據(jù)細胞的生長狀態(tài)建強保護，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基同期；
5） 每日監(jiān)測細胞，觀察存活細胞率使命責任，從而確定抗生素篩選開始4-6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或者所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的藥物最丨低濃度效果。
4. 哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選
等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后，細胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖合規意識，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子密度增加。
1）細胞轉(zhuǎn)染48h后，將細胞（原樣或稀釋）置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)創新內容。
注意：當細胞處于分裂活躍期時機遇與挑戰，抗生素作用最丨明顯。細胞過于密集善於監督，抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降集成技術。最好進行細胞分盤使其密度不超過25%。
2）每隔2-3天更合理，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基大部分。
3）篩選7天后評估細胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間實際需求，這依賴于宿主細胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率解決方案。注意：每日進行細胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48h善謀新篇，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天增產。
4）轉(zhuǎn)移和放置5-10個抗性克隆到一個35mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天方法。此次富集培養(yǎng)是為日后的細胞毒性實驗做準備行動力。
注意事項
1）為了您的安全和健康規模最大，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2）嘌呤霉素為有毒化合物統籌，操作時請小心拿放。
