制備色譜技術(shù)與操作；半制備HPLC：儀器管路粗技術發展，進(jìn)樣體積大（可達(dá)1m集聚效應；制備色譜柱和填料：玻璃柱和不銹鋼柱，填料可為硅膠更為一致；親水樣品選擇正相固定相等形式；大分子選擇離子交換色譜固定相；碳水化合物選擇疏水色譜固定相研究與應用；無機(jī)離子選離子色譜固定相飛躍；合成聚合物選凝膠色譜固定相；立體異構(gòu)樣品選環(huán)糊精固定相全面協議；外消旋樣品選手性固定相重要部署；樣品前處理：萃取、過濾工具、結(jié)晶智慧與合力、固相萃取重要的角色；裝柱方法：
制備色譜技術(shù)與操作

半制備HPLC：儀器管路粗開放要求，進(jìn)樣體積大（可達(dá)1mL以上），進(jìn)樣量大（一般可達(dá)到幾十毫克）平臺建設，檢測池大服務機製，泵耐壓大，流速高（可達(dá)10mL/min甚至更高）使用，柱子內(nèi)徑3cm~100cm大幅拓展，含餾分收集器，可以制備樣品進(jìn)行其它定性檢測足夠的實力，或接分析柱也可進(jìn)行HPLC分析緊迫性。

制備色譜柱和填料 ：玻璃柱和不銹鋼柱，填料可為硅膠、鍵合固定相（如C18）高效、離子交換樹脂 溝通協調、聚酰胺、 氧化鋁體系、 凝膠帶動擴大，對硅膠進(jìn)行硝酸銀（或緩沖液）處理可提高分離效果。疏水樣品選擇反相固定相

親水樣品選擇正相固定相

大分子選擇離子交換色譜固定相

碳水化合物選擇疏水色譜固定相

無機(jī)離子選離子色譜固定相

合成聚合物選凝膠色譜固定相

立體異構(gòu)樣品選環(huán)糊精固定相

外消旋樣品選手性固定相

樣品前處理：萃取開拓創新、過濾、結(jié)晶必然趨勢、固相萃取促進善治。

裝柱方法：顆粒直徑小于20－30um的固定相采用濕法裝填，使相對稀松的固定相懸漿以高速裝入色譜柱子多樣性，從而減少空隙的形成發揮效力。柱直徑大于20mm，所加壓力為30－40bar時明顯，采用柱長壓縮技術(shù)安全鏈，先將固定相懸漿（或偶爾是干填充物）裝入柱中加壓，利用物理方法將其壓緊創新為先，如徑向壓縮和軸向壓縮真正做到。

流動相：色譜分離后要旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，不宜采用高毒性溶劑創新延展，少用多元溶劑強化意識，溶劑的純度也要考慮。堿性流動相不能用于硅膠柱基本情況，酸性流動相不能用于氧化鋁現場、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)，離子交換樹脂＆排阻色譜遇到某些有機(jī)溶劑會膨脹或收縮力量，從而改變柱床的性質(zhì)我有所應。流動相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象深入實施。 流動相選擇方法（1）由強(qiáng)到弱： 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗至關重要， 這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例有效性。（2）三倍規(guī)則：每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量創新內容，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則廣泛關註。

（3）粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)：當(dāng)分離達(dá)到一定程度善於監督，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變更合理。

加樣： 可采用注射器進(jìn)樣適應能力、旋轉(zhuǎn)閥進(jìn)樣、六通閥進(jìn)樣各方面、主泵進(jìn)樣防控、輔泵進(jìn)樣或固體上樣。 檢測器： 一般的分析池的zui大允許流速僅為5 mL/min 或者10mL/min適應性。而專門的制備池的

zui大允許流速可為150mL/min堅實基礎。有時，采用旁路分離管重要作用，將少量流體導(dǎo)入分析池進(jìn)行檢測等地，是一個不錯的辦法，但其濃度的誤差會相對較大尤為突出。

1 問: 我想購買waters600用于分析和制備規定，對于其配備有什么好的建議。

可以配一個PDA空間載體，另外加一個示差折光410高質量，另外買幾根制備柱就可以了。waters600的流速zui大為20mL/min重要組成部分，一般可以配20mm ID的制備柱流程，一次分離10-100mg的樣品，如果樣品量更大有力扭轉，可以通過配件擴(kuò)展到45mL/min上高質量，使用30mm ID的制備柱。另外為了保證餾分收集的準(zhǔn)確性廣度和深度，配上Fraction II 餾分收集器深入交流。如果樣品數(shù)量很大，可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同時做自動進(jìn)樣并通過MS或U號自動收集餾分加強宣傳。zui大通量每天可以處理100-200個樣品處理。

2 問： 如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？

制備色譜柱為Zorbax SB-C18 9.4*250mm及gilson餾分收集器在此基礎上，色譜儀為Agilent 1100或LC-6A助力各行。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進(jìn)行定性分析自主研發。如何設(shè)定色譜條件確定性，如流量，進(jìn)樣量損耗，樣品的濃度講故事，切割點的設(shè)置非常完善，是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除全面革新。（主峰后有二個雜質(zhì)靠得很近作用。）

(1)制備用的流動相等級高一點，否則流動相中的雜質(zhì)會影響LC-MS分析行業分類。

(2)使用餾分收集器時技術特點，延遲體積一定要計算，檢測器的響應(yīng)時間設(shè)到zui小發展邏輯，否則都會影響收集的純度和回收率凝聚力量。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min聽得進，9.4mm制備柱用1*（9.4/4.6）2, 大約為4ml/min註入了新的力量。進(jìn)樣量設(shè)到幾個mg應(yīng)該基本沒有過載。進(jìn)樣樣品濃度越高越好更多可能性。假如進(jìn)樣10mg，理論計算0.05%的雜質(zhì)大約只有5ug足夠的實力，顯然濃度太低緊迫性，是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析更適合。

3 問：我想用hplc分離一個簡單的多肽,我應(yīng)該選用什么樣的流動相,梯度和柱子?

RP-HPLC的C18柱可以制備很少量的肽高效，如果用RP-HPLC，首先應(yīng)該用同類型的分析柱子分析一下多肽含多少雜質(zhì)要素配置改革，設(shè)置緩緩的梯度的分離樣品體系，根據(jù)峰形逐漸放大純化的方法。 4 問：TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)pH的作用呢帶動產業發展？TFA的濃度越高基線的漂移越厲害大局，那是不是說它的濃度在緩沖液pH允許的情況下越低越好呢？

（1）TFA起到類似離子對的作用邁出了重要的一步，一般濃度在0.05-0.1%有序推進，過高的濃度，會使溶液偏酸需求，長

時間使用可能影響柱子壽命堅定不移。（2）同時TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型更讓我明白了。有時0.1%TFA分離不好的話迎難而上。可以考慮加大濃度到0.2%探索。但要注意用完后及時沖洗色譜柱堅持先行。（3）走梯度時產業，因為走成基線漂移，但對制備的影響不大調整推進。

5 問：樣品如果溶解度太低如何上制備HPLC狀況？

（1） 了解一下樣品的性質(zhì),根據(jù)其酸堿性,極性等性質(zhì)，通過調(diào)節(jié)溶劑的pH值等, 以達(dá)到較好的溶解度機製。（2）樣品可能某種晶型難溶全過程，這樣可以加入其他溶劑（如丙酮等）以助溶。

（3）不是一定要用流動相來溶解樣品探討，對溶解度差的樣品不負眾望，可以選擇甲醇，THF或DMSO等溶解樣品調解製度。特別是DMSO精準調控，對一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留應用的因素之一，不會造成干擾解決。而且DMSO的洗脫能力很弱，一般不會影響峰型敢於監督。（4） 可以固體上樣幅度。 6 問：多肽的分離制備, 如何上量？如何增大分離度?

反相HPLC應(yīng)當(dāng)是很好的分離小肽方法重要的作用，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流動相貢獻，看保留如何，若無保留力度，建議改用其他色譜方法進(jìn)行分離明確了方向。

關(guān)于多肽的分離，首先要知道它的分子量大小勇探新路，然后選擇不同類型的填料單產提升，如孔徑的大小。我們先在分析柱（4.6MM內(nèi)徑）上做一下實驗,找到zui大的分離度,這一過程的難度是zui大的,要不斷地改變流動相和固定相,然后再線性或非線性放大到制備,放大的倍數(shù)按分析柱的實驗結(jié)果試驗。分離后可以通過冷凍干燥得到固體行動力。

還可以考慮離子交換來分離多肽。

7 問： 做柱層析時（國產(chǎn)大孔吸附樹脂）切實把製度，怎么才能把洗脫液中的樹脂殘留物處理干凈保供？ 大孔吸附樹脂在上使用前，一般需要進(jìn)行處理進行部署，方法包括用色譜純的甲醇或乙睛洗到?jīng)]有吸收責任；或樹脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天保護好，然后用常規(guī)的酸組建，堿洗表現。再用丙酮回流二小時就可以用了。

8 問：由分析型液相轉(zhuǎn)為制備型液相深刻變革，其色譜系統(tǒng)需作多大調(diào)整結論？是否可以按照柱體積折算只改變流速？其上樣量多大為宜質生產力？

（1）泵要換適應性強，流量要加大，壓力可不變或減少先進的解決方案；流通池要換體積更大的拓展。

（2）整個系統(tǒng)的管路要更換更粗的，否則壓力太大,而且特別容易發(fā)生堵塞宣講活動。對流通池后的管路不斷進步，增加反壓調(diào)節(jié)器，否則管路太短的話效率，反壓小會導(dǎo)致流通池氣泡規模，管路長的話會導(dǎo)致峰展寬。

（3）檢測器的響應(yīng)時間和峰寬要設(shè)置合適講道理，否則會導(dǎo)致收集時延遲體積的計算不準(zhǔn)保持穩定。

（4）上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度面向、制備是否根據(jù)分析條件放大（例如制備柱是否還用分析用填料）；一般上樣量與柱子直徑的平方以及長度成正比研學體驗。

9 問：流動相中含有鹽時建設項目，收集液該如何除鹽？選用揮發(fā)性酸落實落細，堿或鹽（如醋酸銨）是否會在揮干溶劑或凍干過程中直接除去相結合？

一般可以采用離子吸附的辦法去掉（可以參考離子吸附有關(guān)技術(shù)）。但也是稍微麻煩的事情製高點項目，為產業發展，不加酸堿鹽，如果要加的話有所增加，要加揮發(fā)性的或者對產(chǎn)品或者檢測沒有干擾的各項要求。 可用G25脫鹽，它是安馬西亞出的一種葡聚糖凝膠越來越重要的位置。交聯(lián)度大孔徑小,對小分子的無機(jī)鹽保留較大,而對分子量較大的有機(jī)物沒有保留從而可以將鹽份脫除新技術。另外采用揮發(fā)性的酸，堿時順滑地配合，一般會在干燥過程中直接除去深入，但如果樣品也有酸堿性效高，可能會與這些揮發(fā)性酸堿形成一定比例的鹽。

10 問：制備型柱子柱壓上升基礎、柱效下降怎么辦性能？

堵塞柱子的原因：

（1） 如果您所分離的樣品中雜質(zhì)較多而您在上樣前沒有經(jīng)過過濾（0.45微米），一些顆粒性雜質(zhì)會積聚在柱頭造成柱壓升高對外開放，

（2） 也有可能是因為您所使用的流動向中含有緩沖鹽的原因技術創新，結(jié)晶或發(fā)生化學(xué)變化而堵塞∮行蛲七M？梢园阎記_一沖設施。

（3）流動相是否符合液相色譜的要求？是否過濾處理堅定不移？

柱子再生辦法：

（1）依次用水組合運用，甲醇，四氫呋喃迎難而上，甲醇來沖洗柱子脫穎而出，每種溶劑5-10個柱體積。（2）如果效果不明顯生產創效，將柱子按以上順序反沖結構，但一般將大大降低柱子效果。

（3）如果效果還是不好優化上下，就需要打開色譜柱能力建設，超聲波清洗篩片。必要時挖掉色譜柱內(nèi)受污染部位生產體系，填入新的填料服務，還可用3個月。（填的時候小心能力和水平，別重新污染柱子）

11 問：制備柱柱跑干了影響柱效嗎?

如果時間不長的話,可以用流動相多沖幾個小時.柱效不一定變化很大.如果時間太久,柱效一定變低. 具體造成影響有多大覆蓋，要靠柱效測定來確定，而不是干柱時間的長短研究。如果跑干了高效，對于PUMP的影響可能還大些，所以先把管路中的空氣抽走提高。

12 問：制備純化蛋白機構、多肽，耗用流動相驚人交流，請問這些用過的流動相可以重蒸使用嗎攜手共進？

流動相用一般減壓方法重蒸后，往往會形成有機(jī)溶劑和水會共沸推進一步，另外經過，由于減壓蒸餾屬于單次平衡簡單化，往往得不到100%純度的溶劑，這會使溶劑的配置有一定困難明確了方向，從而使色譜的重現(xiàn)性和分離度會發(fā)生一定的變化系統性。如果要求不是很高的話，一般可以分析重蒸后餾分中的各組分含量單產提升，計算后再使用傳遞。

要通過重蒸得到純物質(zhì)是極其困難的，必須采用精餾塔多級蒸發(fā)勞動精神，單就設(shè)備投資和能耗來講開展攻關合作，實驗室規(guī)模或生產(chǎn)規(guī)模的廢液回收處理已經(jīng)是得不償失動手能力。其實逐步改善，我們沒有必要得到純的物質(zhì)。

13 問：反相色譜分離純化后提升，怎樣除去流動相產(chǎn)品中的TFA和乙腈或其他雜質(zhì)大大提高？

TFA是反相色譜分離中常用的添加劑，可以用凍干的辦法去除研究成果，還可以試試離子交換取得了一定進展、凝膠層析、甚至透析和超濾大面積，其中積極參與，離子交換層析效果比較好，還可以起到濃縮樣品的作用培養。 首先交流研討，凍干的辦法應(yīng)該可以幾乎*地除去TFA和乙腈，藥物實驗前先檢測一下凍干品中的殘留量推動，只要不超過允許范圍，這種辦法是zui簡單有效的資源配置。

其次信息，如果你的藥物的分裝量不大的話(<100ug)，建議你用離子交換層析大力發展，裝一個小一點兒的柱子豐富內涵，讓含鹽洗脫峰的蛋白濃度達(dá)10mg/ml以上，稀釋后*符合試驗要求產能提升。如果用分子篩適應性，考慮稀釋，也先過一個離子交換通過活化。此外可以試試疏水層析落地生根。如果產(chǎn)品是堿的話的特點，可能會形成TFA鹽，這樣通過上述方法就無法除去有效保障。一般可以用堿水洗大數據，然后將產(chǎn)品萃取出來≈v實踐；蛘咴诶锩婕尤胍欢康柠}酸數字技術，再干燥后形成鹽酸鹽。

14 問：同一種填料的分析柱改革創新、制備柱按線形放大公式套知識和技能，分離度會不會變化？ 一般會有一定的變化新模式，原因有以下幾點

（1）制備柱的裝填是否均勻實現，如不均勻則可能產(chǎn)生渦流擴(kuò)散使各個組分的經(jīng)過通道的直徑不同、阻力不一樣講理論，停留時間不同的可能性，色譜峰可能變寬。

（2）如果樣品在流動相中溶解度小服務為一體，在制備色譜上會有不同的峰展寬問題。

（3）如果樣品在分析柱上有展寬或拖尾的現(xiàn)象，放大到制備柱上后峰的展寬和拖尾經(jīng)常會非常嚴(yán)重全會精神，導(dǎo)致分離失敗系統穩定性。

15 問：反相色譜分離后，如何快速從流動相中得到產(chǎn)品集中展示？

可以考慮先在低溫下實力增強，減壓旋蒸除去其中的有機(jī)溶劑，然后用萃取的方法把產(chǎn)品萃取出來探索創新，然后再低溫再旋蒸帶來全新智能，這樣，就可以不將溫度升得很高而得到產(chǎn)品新產品。 如果要直接蒸掉流動相去完善，水泵的真空度要注意（要檢查氣密性），否則蒸水會很慢長遠所需。一般比較好的泵在60-70度即可蒸掉水求索，如果泵的真空度不好，可能需要80-90度才行規模，這樣容易暴沸導(dǎo)致樣品損失穩定發展。另為，溫度太高可能引起物質(zhì)變性。