在過去的十年間法治力量，分子生物學領(lǐng)域的一部分重要進展來自于單個細胞內(nèi)全基因組和全轉(zhuǎn)錄組測序研究全技術方案。隨著細胞分離和新一代測序的進步，研究人員不再需要分析來自群體中多個細胞的平均信號共享，而是可以逐個細胞地研究DNA分析，RNA，蛋白質(zhì)和染色質(zhì)投入力度。

  單細胞基因組學，表觀基因組學不難發現，轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學研究揭示出了即使是在同一組織中遺傳相同的細胞之間貢獻法治，基因和蛋白質(zhì)表達依然存在差異。但是來自美國Parker癌癥免疫療法研究所的生物學家Pier Federico Gherardini指出發展需要，目前大多數(shù)此類研究只檢查了每個細胞的單層信息攻堅克難，這可能會產(chǎn)生偏差。“你不能只測量RNA顯示，就由此推測蛋白質(zhì)看起來都一樣雙向互動。”


現(xiàn)階段，科學家們已經(jīng)開始以單細胞分辨率組合多層信息設計能力。這些“多組學”技術(shù)可以更仔細地觀察細胞之間的可變性品牌，更清楚地識別特定細胞及其功能。分析基因組DNA揭示了單細胞基因組更為一致，甲基化組織或染色質(zhì)等形式，而分析RNA和蛋白質(zhì)則能分別產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。


“多組學比單一層的組學分析更強大研究與應用，”英國Sanger研究所的分子生物學家Lia Chappell說飛躍，“這樣才能開始解開所有異質(zhì)性的真正含義，能夠深入挖掘生物機制全面協議。”


維也納CeMM分子醫(yī)學研究中心的基因組研究員Christoph Bock認為重要部署，單細胞多組學特別適用于檢查發(fā)生快速變化的細胞具體而言，如活化的免疫細胞，或非常異質(zhì)組織中的細胞智慧與合力，包括腫瘤喜愛。


這種方法還可以識別在大量群體中被掩蓋的罕見但具有生物學重要性的細胞。 Chappell說：“一個典型的例子是那些抗藥性低的細胞促進進步，在群體研究中我們無法找到它們發力，因為他們被上千倍更多的細胞淹沒了。”


然而迎來新的篇章，單細胞多組學研究并不容易共創美好。目前對于任何單細胞多組學技術(shù)，還沒有可用的商業(yè)試劑盒薄弱點，并且許多技術(shù)還存在限制覆蓋範圍。研究人員必須修改現(xiàn)有的單細胞方案，使其與多種類型的分子兼容重要性，并且要非常小心地將樣品的損失或污染降至zui低又進了一步。


基因組和轉(zhuǎn)錄組

同時對來自相同細胞的DNA和RNA進行測序可以揭示單個細胞之間的基因組變異，解釋其轉(zhuǎn)錄水平的變化多元化服務體系。這樣做還可以更準確地檢測DNA突變規劃。


DR-seq（DNA-mRNA sequencing）這種測序方法發(fā)表于Nature Biotechnology[1]，通過裂解單細胞深度，并同時擴增裂解物中的DNA和RNA帶動擴大。然后將裂解物分成兩半，一個用于RNA測序（RNA-seq）開拓創新，另一個用于基因組測序持續發展。這樣在擴增過程中將DNA和RNA保持在一起，可以zui大限度地減少核酸的損失促進善治，但可能會導(dǎo)致潛在的交叉污染擴大。


G＆T-seq（genome and transcriptome sequencing）則是另外一種重要方法[2]，早在2015年生物通就報道過這種技術(shù)（Nature Methods發(fā)布重磅測序技術(shù)：基因組和轉(zhuǎn)錄組平行測序）發揮效力，研究人員當時用G&T-seq對220個小鼠和人類細胞進行測序新格局，獲得了詳細的信息。


具體來說安全鏈，這種技術(shù)就是利用涂有結(jié)合mRNA的短寡核苷酸序列的磁珠最新，物理性地從*裂解的細胞中分離mRNA和DNA。然后將DNA和mRNA分別擴增和測序處理方法。這樣讓保持mRNA和DNA分離重要作用，允許研究人員使用他們選擇的方案分析每種分子，但這可能導(dǎo)致核酸的損失習慣。 目前G＆T-seq已實現(xiàn)自動化充足，通量相對較高進展情況。


表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組

分析細胞表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)可以揭示甲基化和染色質(zhì)可接近性（chromatin accessibility，生物通注）對基因表達的調(diào)控作用綠色化發展。


“在腫瘤發(fā)生等復(fù)雜的生物過程中至關重要，異質(zhì)性同時存在于基因組，表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組中用上了，單獨分析它們可能不起作用提升行動，”北京大學分子生物學家湯富酬教授說￡P註；蛳嗤哪[瘤細胞可能具有不同的DNA甲基化或基因表達模式有效性，可能需要多組學技術(shù)才能明確地將它們分類為亞群。


scM＆T-seq（simultaneous single-cell methylome and transcriptome sequencing）能同時完成單細胞甲基化組和轉(zhuǎn)錄組測序分析[3]機遇與挑戰，這種方法基于G＆T-seq廣泛關註，采用相同的方法從單個細胞中分離DNA和RNA，并擴增和測序RNA集成技術。對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理就能壓製，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為*，然后擴增并測序以測定甲基化組適應能力。


研發(fā)技術(shù)人員表示更優美，“這一新的實驗方案讓你可以并行分析同一單細胞中的DNA甲基化和RNA。我們的方法提供了有關(guān)單細胞DNA甲基化異質(zhì)性與特定基因表達差異之間關(guān)系的shou個直觀視圖防控。”（Nature Methods：突破性單細胞表觀基因組與轉(zhuǎn)錄組分析新技術(shù)）


scNMT-seq（single-cell nucleosome, methylation, and transcription sequencing）則是在scM和T-seq基礎(chǔ)上發(fā)展起來的[4]合作關系，不過這種技術(shù)需要將單細胞分離出來，進行處理深刻內涵，檢測全基因組染色質(zhì)可接近性。不同基因組位置的可接近性融合，或者保護性會影響基因表達深入闡釋，使用scNMT-seq可以發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細胞中表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組之間的新關(guān)聯(lián)。


scMT-seq（another method of simultaneously sequencing single cells’ methylomes and transcriptomes）是同時測序單細胞的甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的另一種方法[5]完成的事情，這種是加州大學范國平教授和同濟大學薛志剛教授研發(fā)的物聯與互聯，他們利用這種方法對感覺神經(jīng)元進行研究，揭示了細胞間的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組異質(zhì)性改造層面。不過供給，這些差異大多不是啟動子甲基化造成的。舉例來說經驗分享，啟動子帶CpG島的基因解決方案，表達水平與基因體甲基化正相關(guān)。這項研究表明有力扭轉，scMT-seq可以用來檢測單細胞中的轉(zhuǎn)錄組上高質量、甲基化組和單核苷酸多態(tài)性信息一站式服務，進而解析表觀遺傳學基因調(diào)控機制。（同濟大學發(fā)布單細胞測序新技術(shù)）

scTrio-seq（single-cell triple omics sequencing是一種單細胞三重組學測序方法[6]深入交流，由北京大學湯富酬教授等人研發(fā)引領作用，這種全新的單細胞三重組學測序方法在上從同一個單細胞中實現(xiàn)對三種組學高通量測序信息的同時獲取，并從單細胞水平發(fā)現(xiàn)肝癌細胞在三種組學上存在密切相互關(guān)聯(lián)的高度異質(zhì)性處理。


scTrio-seq選擇性裂解細胞膜建設，將細胞質(zhì)中的mRNA與完整細胞核中的基因組DNA分開。對于scMT-seq助力各行，實驗人員是利用微量移液管收集細胞核前來體驗，而在scTrio-seq中，則是通過離心分離細胞核應用。兩種情況中建議，基因組DNA都是進行的改良亞硫酸鹽處理和測序方法來檢測甲基化組，而來自細胞裂解物的mRNA則是平行擴增和測序相貫通。


“基本上在基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間沒有交叉污染不斷發展，”湯教授表示。scTrio-seq使用甲基化組序列數(shù)據(jù)計算評估基因組拷貝數(shù)變異自動化方案，這種技術(shù)已用于分析人結(jié)直腸癌樣本中的異質(zhì)性緊密協作。


蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組

還有幾種技術(shù)可以同時測定來自單個細胞的轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)。這些方法為科學家提供了轉(zhuǎn)錄后的研究線上線下，分析導(dǎo)致蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄水平之間的差異發揮重要作用。


PLAYR（proximity ligation assay for RNA）技術(shù)中，蛋白質(zhì)被不同金屬同位素的抗體標記數據顯示。同時高質量，RNA轉(zhuǎn)錄物被同位素標記的探針結(jié)合。利用一種稱為質(zhì)譜流式細胞技術(shù)（mass cytometry）的方法測量同位素記得牢，并且這種技術(shù)也可以同時檢測每秒數(shù)千個單細胞中的40多種不同的mRNA和蛋白質(zhì)註入了新的力量。


CITE-seq（cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing）采用寡核苷酸標記的抗體靶向細胞表面蛋白。這種技術(shù)分離并裂解單個細胞更多可能性，并將它們的mRNA和寡標記抗體與涂有短寡核苷酸序列的磁珠結(jié)合去創新。擴增RNA和抗體標簽并按大小分離，通過測序定量分析蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物緊迫性。CITE-seq還可同時檢測約100種蛋白質(zhì)以及數(shù)萬種RNA轉(zhuǎn)錄物結構。


Marlon Stoeckius是紐約基因組中心的分子生物學家，他是這項技術(shù)的研發(fā)者高效。目前Stoeckius正致力于將該方法擴展到細胞內(nèi)蛋白質(zhì)溝通協調，不過這需要固定和透化細胞，這可能會降低RNA質(zhì)量或?qū)е缕鋸募毎袧B出體系。


REAP-seq（RNA expression and protein sequencing assay）類似于CITE-seq帶動擴大，采用寡核苷酸交聯(lián)抗體來檢測細胞蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物水平（基于測序）核心技術體系。


REAP-seq和CITE-seq都可以檢測很多的轉(zhuǎn)錄本，但與PLAYR相比核心技術，每次檢測的細胞數(shù)量更少應用提升。


“我認為它們是互補的方法，”PLAYR的開發(fā)人員Gherardini說創造性，“如果你有一個大的隊列或臨床研究發展的關鍵，像PLAYR這樣的東西會更加經(jīng)濟有效”。


CITE-seq還有一個優(yōu)點就是蛋白質(zhì)定量可以在通常單細胞RNA測序制備中丟棄的部分進行規模設備，因此“對RNA測序文庫的質(zhì)量沒有任何損害真諦所在，”紐約基因組中心的Peter Smibert說，“我們認為如果采用RNA-seq作為讀數(shù)競爭力，那么就可以使用CITE-seq充分。”



如何做出選擇

有了這么多種的檢測方法可供選擇，研究人員還需要根據(jù)他們提出的生物學問題集聚，特定技術(shù)的成本競爭力，勞動密集程度和技術(shù)要求來決定使用哪些檢測方法。


“通常這需要技術(shù)專家團隊狀況，計算人員和了解實驗系統(tǒng)的生物學家合作才能很好地完成這些類型項目的研究機製性梗阻，”Bock說。


如何制定技術(shù)方案全過程，選擇方法取決于很多因素集成應用，各種技術(shù)的實驗指南存在的一大差異是如何從組織中分離單個細胞，口腔移液和連續(xù)稀釋是相對快速不負眾望，簡便和低成本的方法高效流通，可以zui大限度地降低RNA或蛋白質(zhì)降解的風險，但它們通量也相對較低精準調控。FACS功能，機器人操作和微流體是高通量的，但它們很昂貴并且可能在細胞分離上沒有那么精細機遇與挑戰。


成本是另一個因素∩旗侗O督；谥改虾驮噭┑捏w積（例如酶和抗體）集成技術，上述這些技術(shù)的價格每個樣品從幾美元到幾百美元不等（這不包括測序的成本，當然測序也可能是限制性的問題）更合理。 “沒有多少科學家能夠從單個細胞中測序十萬個單基因組適應能力，”Chappell說。


對于一批樣品實際需求，單細胞多組學測定可以需要花費超過24小時到近一周的時間解決方案，其中涉及手動將細胞核與細胞質(zhì)分離的方法往往較慢優勢，且勞動強度較大，而基于FACS的方法更方便增產，通量更高便利性。


生物信息學專業(yè)知識是一個優(yōu)勢。 Stoeckius說：“對于所有的這些分析行動力，你需要一點計算機背景和一些R經(jīng)驗提供有力支撐，”這是一種用于統(tǒng)計計算和數(shù)據(jù)分析的編程語言和軟件環(huán)境。


不過這種情況也可能很快就會改變保供，因為越來越多的人開始使用這種分析自行開發，一些公司開發(fā)了易于使用的軟件來分析單細胞多組學數(shù)據(jù)。目前責任，諸如SEURAT和MOFA之類的計算軟件包可以集成來自兩個或多個組學層的數(shù)據(jù)應用情況。


隨著單細胞單組學技術(shù)變得更加靈敏，準確和高通量組建，相應(yīng)的多組學技術(shù)也可能得到改善表現。研究人員還致力于將單細胞技術(shù)與其它數(shù)據(jù)層相結(jié)合，例如空間信息（如CODEX）和功能分析作用。將細胞的空間信息鏈接到其他組學層可以幫助研究人員在組織內(nèi)映射不同的細胞類型和功能相互配合。


zui終的目標還是從單個細胞中捕獲所有分子的信息——一種“”的信息，但這仍然需要幾年時間著力增加。目前智能化，單細胞多組學正在改變科學家處理分子生物學的方式。