ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定開展面對面。但ELISA測(cè)定中影響因素較多至關重要，而且其操作中有一定的技術(shù)要求應用領域，在檢測(cè)過程中除正常反應(yīng)外不斷豐富，有時(shí)常見到一些錯(cuò)誤的結(jié)果實施體系。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：①標(biāo)本因素；②試劑因素各有優勢；③操作因素效果較好。下面就一些常見ELISA操作過程中的問題一一分析。

    1．樣品稀釋

       酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)持續，如果血清不稀釋等多個領域，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性產品和服務。因此應用擴展，國(guó)外檢測(cè)血清抗體的試劑盒更讓我明白了，均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)指導，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來範圍。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗(yàn)確定進一步推進，以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性導向作用。但是，有些用戶未能嚴(yán)格按使用說明書操作應用的選擇，如某些產(chǎn)品應(yīng)取10μl樣品進(jìn)行稀釋十大行動，個(gè)別用戶取5μl甚至1μl樣品進(jìn)行稀釋，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠背景下，因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確綜合措施，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)問題。

    2．試劑盒平衡

       試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫（約25℃），一般需在室溫放置20～30分鐘以上建言直達。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠多種，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分充分發揮。冬季室溫低發展成就，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。

    3．樣品和試劑的混勻

    稀釋前重要方式、后的樣品必須充分混勻開展面對面，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗(yàn)的均一性無障礙。

    4．加樣

    在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中連日來，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快認為，要避免加在孔壁上部系統，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快重要意義，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性交流等。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附規劃。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染提高。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以進入當下，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性紮實，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致新體系。

    5．溫育

    溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗為關(guān)鍵的一個(gè)因素投入力度。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行長效機製，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合法治力量，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比分享，即溫度越高共享，則所需時(shí)間相對(duì)較短。為常用的溫育溫度有37℃和室溫方式之一，其次是43℃和2～8℃生動。一些操作者，擅自改變說明書操作創新能力，使用自己喜歡的溫育時(shí)間和溫育溫度新品技，這樣造成一些不必要的麻煩範圍。因?yàn)椋煌噭┖杏胁煌臏赜龝r(shí)間和溫育溫度的選擇紮實做，隨意更改溫育時(shí)間或者溫育溫度將導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差空間廣闊。

    6．洗板

    固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來提供深度撮合服務，以保證ELISA測(cè)定的特異性用的舒心。洗板對(duì)于ELISA測(cè)定來說，也是極其關(guān)鍵的一步集聚效應。洗液盡量不要溢出孔外集成；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后互動講，一定要大力拍干穩定性；及時(shí)更換吸水紙，尤其是拍過酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去過程中，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果去突破。

    7．邊緣效應(yīng)

    使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”達到，即外周孔顯色較中心孔深具體而言。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體智慧與合力，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱重要的角色，板也升溫時(shí)開放要求，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)平臺建設，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃）服務機製，就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測(cè)定的重復(fù)性使用。

    8．顯色

    顯色一定要控制時(shí)間,根據(jù)試劑盒說明操作即可大幅拓展。一般來說，顯色時(shí)間過短更加堅強，結(jié)果偏低與時俱進；顯色時(shí)間過長(zhǎng)，空白增高或者非特異性顯色增加初步建立。

    9．比色
 

    比色要注意波長(zhǎng)的選擇綜合運用。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm的方法，后者為492nm實事求是，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換進行探討。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問題責任製。