該試劑盒用于從克隆菌中大量提取去除內(nèi)毒素的高品質(zhì)質(zhì)粒，一般來(lái)說(shuō)可從200ml過夜培養(yǎng)的菌液中提取高拷貝質(zhì)粒600-1200ug覆蓋範圍，低拷貝質(zhì)粒50-400ug。試劑盒自帶的說(shuō)明書為英文說(shuō)明書基礎上，不是非常方便閱讀各領域，所以本文根據(jù)英文原版重新翻譯了一遍，希望對(duì)大家有幫助保持競爭優勢。
 

　　實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
 

　　1. 使用前,將RNase A全部加入Solution I中并于4度保存進行培訓。
 

　　2. 按下表用無(wú)水乙醇稀釋DNA Wash Buffer，并于室溫保存長效機製。
 

　　試劑盒型號(hào)    加入的乙醇量(ml)
 

　　D6926-00B    60
 

　　D6926-01B    160
 

　　D6926-03B    200
 

　　D6926-04B    200每瓶
 

　　細(xì)菌的培養(yǎng)：
 

　　1. 在容積為1-4升的培養(yǎng)瓶中加入200ml含篩選抗生素的LB培養(yǎng)基法治力量，加入含目的質(zhì)粒的克隆菌(一般為1/1000比例接種，也即200ul)分享，然后置37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)共享。為了獲得*的效果，*接菌使用經(jīng)過夜培養(yǎng)活化的菌種經驗分享。對(duì)于大多數(shù)質(zhì)粒的提取解決方案，我們強(qiáng)烈*使用endA陰性的菌種，比如DH5α和JM109有力扭轉。
 

　　*的培養(yǎng)條件對(duì)于質(zhì)粒DNA的得率至關(guān)重要上高質量。*的培養(yǎng)條件包括，首先由新轉(zhuǎn)化或新劃線的培養(yǎng)板中挑取單個(gè)克隆廣度和深度，然后接種于2-5ml含合適篩選抗生素的培養(yǎng)基中深入交流，37℃振蕩(搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定在約300rpm為宜)培養(yǎng)約8小時(shí)；然后繼續(xù)接種于含抗生素的預(yù)熱的液體培養(yǎng)基中加強宣傳，37℃振蕩(~300rpm)培養(yǎng)12-16小時(shí)臺上與臺下。盛培養(yǎng)基的容器的容積需至少為培養(yǎng)基體積的3-4倍(注：保證培養(yǎng)環(huán)境中有足夠的氧氣，防止厭氧菌的繁殖)設計能力，初始培養(yǎng)基接種的稀釋比例為1/500到1/1000為宜品牌。
 

　　為了獲得*的效果，我們*每次培養(yǎng)后測(cè)定OD600值更為一致。對(duì)于過夜培養(yǎng)活化的細(xì)菌而言等形式，OD600的值處于1.5-2.0之間是細(xì)菌生長(zhǎng)良好的指標(biāo)。在測(cè)定OD600時(shí)，為了保證測(cè)量值處于光度計(jì)測(cè)量的線性范圍(0.1-0.5)飛躍，需將培養(yǎng)物進(jìn)行必要的稀釋(10到20倍)更高效。當(dāng)接種進(jìn)行大量培養(yǎng)時(shí)，我們*細(xì)菌的終密度在2.0-3.0之間為宜重要部署。當(dāng)使用富營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基具體而言，需要注意保證細(xì)菌的密度不要超過OD600為3.0；如果使用凍存的甘油菌智慧與合力，需要首*行劃線并挑取單克隆喜愛，然后和前面一樣進(jìn)行必要的活化。
 

　　富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基如2xYT或TB開放要求，不*使用本試劑盒向好態勢。
 

　　堿性-SDS溶液裂解細(xì)菌：
 

　　2. 取100-200ml菌液3,500-5,000xg室溫離心10min收集菌體沉淀。
 

　　3. 小心去除上清液服務機製，為了保證所有上清去除*貢獻力量，可使用干凈的紙巾將容器壁上液滴吸除，加10ml Solution Ⅰ/RNase A , 渦旋或用移液槍上下吹打重懸菌體大幅拓展，重懸*對(duì)于獲得zui高的得率至關(guān)重要;
 

　　4. 加10ml SolutionⅡ去創新，來(lái)回顛倒10-15次輕柔混勻，以得到澄清的裂解液緊迫性。如有必要可室溫孵育2min結構。
 

　　避免混合時(shí)動(dòng)作過于劇烈，過于劇烈會(huì)剪切細(xì)菌的染色體DNA(從而在接下來(lái)的步驟中不能被充分沉淀)并且導(dǎo)致質(zhì)粒的純度降低高效。(當(dāng)Solution II在不使用時(shí)規劃，需要將瓶蓋旋緊，防止空氣中的CO2與Solution II反應(yīng)生成碳酸鹽)
 

　　5. 加5ml Buffer N3深度，輕輕顛倒充分混勻幾次直至白色絮狀沉淀出現(xiàn)帶動擴大。室溫放置2—3min，期間偶爾顛倒混合開拓創新，以使其充分反應(yīng)持續發展。
 

　　注意：該溶液必須充分混合。如果混合物依然非常的粘滯促進善治，呈褐色并且成團(tuán)狀擴大，則需要進(jìn)一步混合以充分中和該溶液，充分中和對(duì)于獲得更好的得率至關(guān)重要發揮效力。使用冰預(yù)冷的Buffer N3將有利于沉淀更多的細(xì)菌蛋白新格局。
 

　　6. 準(zhǔn)備結(jié)合柱：加5ml的Buffer GPS至結(jié)合柱中，室溫放置3—10min安全鏈，3,000—5,000×g室溫離心5min顯示，棄濾液(注：這里中文說(shuō)明書中添加了一步“往柱子里加入10ml無(wú)菌水離心棄濾液”創新為先，而在英文原版中是沒有的)，把柱子插回50ml收集管中科普活動。(注：這里可以使用一個(gè)舊的50ml離心管收集廢液創新延展，而將試劑盒中附帶的新離心管用于zui后一步質(zhì)粒洗脫時(shí)使用)。
 

　　使用針筒式過濾器過濾裂解物：
 

　　7. 將第5步得到的裂解液及沉淀物全部轉(zhuǎn)移至針筒式過濾器中長期間，準(zhǔn)備一個(gè)干凈的50ml離心管收集濾液基本情況。將過濾器的活塞插回針筒。
 

　　8. 將針筒對(duì)準(zhǔn)50ml收集管高端化，輕輕推動(dòng)活塞力量，收集澄清的濾液。一些裂解液中可能仍然殘留有絮狀沉淀物提單產，不要強(qiáng)行將這些殘留的裂解液推擠過柱提升行動。
 

　　9. 加入等體積的ETR Binding Buffer(~25ml)到結(jié)合柱上，上下反復(fù)顛倒7-10次密度增加。
 

　　使用HiBind結(jié)合柱純化質(zhì)粒DNA(注：離心法，適用于同時(shí)抽提多個(gè)樣品創新內容，對(duì)于樣本量較少時(shí)機遇與挑戰，*使用后面的真空抽濾法)
 

　　10. 小心轉(zhuǎn)移裂解液至HiBind結(jié)合柱，3,000—5,000×g離心3—5min,使液體濾過柱子善於監督，棄濾液集成技術。
 

　　11. 重復(fù)步驟10，直至所有裂解液都過濾完更合理，棄濾液適應能力。
 

　　12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min,使全部液體濾過柱子各方面，棄濾液防控。
 

　　13. 加入10ml Buffer EHB到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子適應性，棄濾液堅實基礎。
 

　　14. 加入15ml DNA Wash Buffer(預(yù)先添加了乙醇)到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子重要作用，棄濾液等地；
 

　　注意：試劑盒附帶的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標(biāo)簽的提示用無(wú)水乙醇稀釋。如果試劑是低溫保存的尤為突出，使用前需要預(yù)先恢復(fù)溫度至室溫規定。
 

　　15. 加入10ml DNA Wash Buffer到結(jié)合柱上3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液空間載體；
 

　　16. 把空柱子套回離心管高質量，zui大轉(zhuǎn)速(不超過6,000×g)離心10—15min使柱子充分干燥相對簡便。不要跳過該步驟-該步對(duì)于去除柱子中殘留的乙醇非常關(guān)鍵。
 

　　使用HiBind結(jié)合柱純化質(zhì)粒DNA(注：真空抽濾法解決方案，對(duì)于樣品個(gè)數(shù)較少時(shí)趨勢，該方法比較節(jié)省時(shí)間)
 

　　10. 安裝好抽濾裝置，將結(jié)合柱與抽濾瓶密閉結(jié)合
 

　　11. 轉(zhuǎn)移裂解液至HiBind結(jié)合柱上高質量，使液體全部濾過柱子一站式服務。
 

　　12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結(jié)合柱上，洗滌一次(注：流速可能會(huì)比較慢)深入交流。
 

　　13. 加入10ml Buffer EHB到結(jié)合柱上引領作用，洗滌一次。
 

　　14. 加入15ml DNA Wash Buffer(預(yù)先添加了乙醇)到結(jié)合柱上處理，洗滌一次建設。
 

　　15. 再次加入10ml DNA Wash Buffer，洗滌一次助力各行。
 

　　16. 繼續(xù)抽真空10-15min前來體驗，以充分干燥結(jié)合柱(注：當(dāng)抽提多個(gè)樣品時(shí)，可以選擇離心法步驟16中的方法以節(jié)約時(shí)間)確定性。
 

　　由結(jié)合柱洗脫質(zhì)粒DNA(常規(guī)方法更加廣闊，也可以使用后面介紹的另一種洗脫方法)
 

　　17. 進(jìn)一步干燥柱子：選擇以下任一種方法在洗脫前進(jìn)一步干燥結(jié)合柱
 

　　A. 將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移真空抽濾裝置上室溫抽濾15min
 

　　B. 將結(jié)合柱放入65℃恒溫烤箱，烘烤10—15min
 

　　18. 把結(jié)合柱套在一個(gè)新的50ml離心管中(注：可以使用試劑盒附帶的離心管)講故事，加入1—3ml(注：依據(jù)要求的質(zhì)粒終濃度非常完善，可以分步兩次洗脫，第1次少量洗脫保證得到高濃度的質(zhì)粒全面革新，第二次稍加大洗脫體積作用，保證盡可能將質(zhì)粒洗脫*) Endotoxin-Free Elution Buffer(或去離子水)至結(jié)合柱的膜上，室溫放置2—5min行業分類，以zui高轉(zhuǎn)速離心(不超過6,000xg)5min洗脫質(zhì)粒DNA技術特點。
 

　　上面描述的方法可以回收大約60-80%柱結(jié)合的DNA。也可以選擇進(jìn)行二次洗脫從而將所有殘留的DNA全部回收發展邏輯，但二次洗脫的DNA濃度會(huì)低一些高質量。另外，第二次洗脫也可以使用*洗脫下來(lái)的液體以保證得到較高濃度的質(zhì)粒DNA記得牢。將洗脫液或去離子水預(yù)熱至70℃并且在洗脫前註入了新的力量，室溫放置2min，可能會(huì)顯著提升zui終的得率更多可能性。
 

　　注意：使用該方法得到的質(zhì)寥撔?？梢院芎玫膽?yīng)用與PCR，限制性酶切緊迫性，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等結構。預(yù)期的質(zhì)粒濃度可能依據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)不同存在一些出入更適合。但是，一般來(lái)說(shuō)高拷貝的質(zhì)粒終濃度在150-600ug/ml溝通協調。該方法得到的質(zhì)烈嘏渲酶母?？赡軙?huì)包含一些乙醇?xì)埩簦话悴粫?huì)影響下游實(shí)驗(yàn)保障性。如果需要獲得更高的質(zhì)粒濃度和*去除乙醇?xì)埩粲绊懥爣?，可以選擇使用下面的方法。
 

　　另一種結(jié)合柱洗脫質(zhì)粒DNA的方法
 

　　1. 把結(jié)合柱套在一個(gè)新的50ml離心管中(注：可以使用試劑盒附帶的離心管)新創新即將到來，加入6ml Endotoxin-Free Elution Buffer(或去離子水)至結(jié)合柱的膜上邁出了重要的一步，室溫放置2min，以zui高轉(zhuǎn)速離心(不超過6,000xg)5min以洗脫質(zhì)粒DNA設施。將洗脫液或去離子水預(yù)熱至70℃并且在洗脫前需求，室溫放置2min，可能會(huì)顯著提升zui終的得率組合運用。
 

　　2. 將洗脫的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的適用于沉淀的離心管中更讓我明白了。加入260ul 5M NaCl以及4.4ml室溫放置的異丙醇。渦旋以充分混勻積極，然后以不低于15,000×g轉(zhuǎn)速4℃離心30min探索。小心地去除上清。
 

　　3. 用2ml 70%的乙醇洗滌沉淀一次集聚，以不低于15,000×g轉(zhuǎn)速4℃離心10min，小心地去除上清調整推進顩r？諝飧稍锍恋?-10min。
 

　　4. 加入200-500ul(依據(jù)要求的質(zhì)粒終濃度)Endotoxin-Free Eluiton Buffer或去離子水重懸DNA機製。