分光光度計(jì)的應(yīng)用常識--諾頂儀器信息網(wǎng)

點(diǎn)擊次數(shù)：680 發(fā)布時(shí)間：2014-11-9

1持續創新、蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）

　　這種方法是在280 nm波長改善，直接測試蛋白。選擇Warburg公式協調機製，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度重要的角色，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度向好態勢。

　　蛋白質(zhì)測定過程非常簡單平臺建設，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)貢獻力量。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)使用，一般要消除320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”發行速度。與測試核酸類似更加堅強，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5之間。實(shí)驗(yàn)中選擇 Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)初步建立，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”實施體系。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上各有優勢，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過 1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定重要的意義。

　　漂移的原因是因?yàn)閃arburg公式吸光值換算成濃度持續，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變再獲，濃度就會(huì)被放大產品和服務，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。

　　蛋白質(zhì)直接定量方法體驗區，適合測試較純凈增多、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說有望，速度快進一步推進，操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低方案，要求蛋白的濃度較高應用的選擇。

　　比色法蛋白質(zhì)定量

　　蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如*左右，*）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)背景下，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)可靠保障，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度基本情況。

　　比色方法一般有 BCA關鍵技術，Bradford知識和技能，Lowry 等幾種方法推進高水平。

　　Lowry 法：以zui早期的 Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)尤為突出，并有所改進(jìn)不同需求。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng)求得平衡，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物供給。但是與Biuret相比重要部署，Lowry法敏感性更高關註。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA研究進展，Tritonx-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法連日來。BCA（Bicinchoninine acidassay）法：這是一種較新的快速融入、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生 Cu+系統，后者與 BCA形成螯合物增強，形成紫色化合物重要意義，吸收峰在 562 nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*更加廣闊，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定規劃。相對于Lowry 法，操作簡單可以使用，敏感度高進入當下。但是與 Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

　　Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)效高化，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595 nm新體系。其zui大的特點(diǎn)是，敏感度好創造，是Lowry 和 BCA 兩種測試方法的2倍;操作更簡單不難發現，速度更快;只需要一種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果;而且與一系列干擾 Lowry設備製造，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT發展需要，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的信息化。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大方式之一，無可比性。

　　某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致趨勢，感到迷惑有力扭轉，究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性一站式服務。例如：Keller等測試人奶中的蛋白廣度和深度，結(jié)果Lowry，BCA測出的濃度明顯高于Bradford引領作用，差異顯著加強宣傳。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致用的舒心，測試后的濃度也不一致技術發展。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA 作標(biāo)準(zhǔn)品集成，濃度1.34 mg / ml重要手段，以 a 球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度 2.64 mg/ml穩定性。因此像一棵樹，在選擇比色法之前，是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品能運用。另外達到，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低不可缺少，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大蓬勃發展。關(guān)鍵問題是，反應(yīng)后的顏色是有一定的半衰期積極回應，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時(shí)間開放要求，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測試平臺建設。時(shí)間過長，得到的吸光值變小貢獻力量，換算的濃度值降低使用。除此，反應(yīng)溫度發行速度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因更加堅強。此外，非常重要的是結構，是用塑料的比色法更適合。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色溝通協調，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確要素配置改革。

2、核酸的定量

　　核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能保障性赢a業發展？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈十分落實、雙鏈DNA倍增效應，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260nm製造業。每種核酸的分子構(gòu)成不一優化服務策略，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸發展基礎，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)兩個角度入手。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA顯示，40μg/ml的RNA創新為先，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度創新延展。測試前強化意識，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積基本情況，爾后測試空白液和樣品液現場。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順力量。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問題我有所應。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大深入實施。

　　事實(shí)上至關重要，的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化效果，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度應用的因素之一。如EppendorfBiophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)預期，都是正常的敢於監督。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值結構，離子濃度等：在測試時(shí)重要的作用，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移規模最大，因此建議使用pH值一定穩中求進、離子濃度較低的緩沖液，如TE最深厚的底氣，可大大穩(wěn)定讀數(shù)適應性。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品稍有不慎。這些小顆粒的存在干擾測試效果重要作用。為了zui大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A最為顯著，吸光值在0.1-1.尤為突出。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小環境，結(jié)果穩(wěn)定空間載體。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測試范圍）相對簡便。zui后是操作因素重要組成部分，如混合要充分流程，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡勃勃生機，空白液無懸浮物助力各業，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的zui小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)提供有力支撐。

　　除了核酸濃度應用，同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如 A 260 / A280的比值品率，用于評估樣品的純度相貫通，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?280 nm。純凈的樣品創造更多，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）宣講活動。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響工藝技術。A230表示樣品中存在一些污染物確定性，如碳水化合物，多肽損耗，*等，較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0非常完善。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子性能穩定。純樣品，A 320 一般是 0作用。

3情況正常、細(xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）

　　實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測推斷細(xì)菌的生長密度技術特點。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)提高鍛煉，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法凝聚力量。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液有所提升，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作新的力量，必須針對每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)先進水平，做出校正曲線。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值全面展示，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基重要平臺，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)核心技術，發(fā)生變色反應(yīng)應用提升。另外主動性，需要注意的是，測試的樣品不能離心發展的關鍵，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)道路。