流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒說明書

1.試劑盒簡介貨

流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒主要感染當年草魚種和青魚連日來，死亡率可達80%以上服務水平。其它淡水鯉科魚，如鰱魚管理、鳙魚顯示、鯽魚、鯉魚感染后沒有臨床癥狀效率和安，但可以攜帶病毒到處傳播設計能力。該病在水溫高于20℃以上時流行, 25～28℃為流行高峰。常見的臨床癥狀為眼突出深入開展、體色發(fā)黑更為一致，口腔、鰓蓋和鰭條基部出血技術的開發。撕開表皮研究與應用，可見肌肉出現(xiàn)點狀或塊狀出血。剖檢腹腔, 可見腸道充血, 肝更高效、脾充血或因失血而發(fā)白全面協議。病原為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員具體而言。病毒為直徑70nm的球形顆粒越來越重要，有雙層衣殼，無囊膜發揮重要作用，含有11個片段的雙鏈RNA醒悟。根據(jù)片段長度大小分為大（L1、L2高質量、L3也逐步提升，大小在4.0kb～3.7kb）、中（M4智能設備、M5不可缺少、M6，大小在2.5～2.0kb）特點、蟹e極回應。⊿7、S8又進了一步、S9多種場景、S10、S11, 大小在1.6～1.0kb) 三組規劃。在不同地區(qū)存在抗原性擴大公共數據、核酸電泳圖譜、對細胞的敏感性和對魚的毒力都有一定差異的毒株帶動擴大。多年研究已經(jīng)確定的有二個典型的代表株：GCRV-873為湖南株核心技術體系，能在CO、CIK等細胞中大量增殖并出現(xiàn)CPE，癥狀以內(nèi)臟出血為主必然趨勢；GCRV-9014為湖北株促進善治，能在CIK、CO細胞中大量增殖多樣性，但不產(chǎn)生CPE發揮效力，癥狀以肌肉出血為主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%明顯。為了適應草魚出血舶踩?。℅CRV）快速檢測和疫病研究的需要，本公司嚴格依據(jù)SN/T3584-2013草血病檢疫技術(shù)規(guī)范規(guī)定的檢測GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標準創新為先，在本公司嚴謹?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下生產(chǎn)和質(zhì)檢真正做到。確保本試劑盒滿足標準的檢測要求。本試劑盒具有快速靈敏優化服務策略、特異關規定、準確、安全兩個角度入手、操作簡單建強保護、應用廣泛等特點及優(yōu)點。

2生產效率、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴增試劑使命責任。具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

*： 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴增試劑： DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應液

酶混合物陰性對照

GCRV-9014 陽性對照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

（注：*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）

3、樣本采集,存放及運輸

3.1流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干使用。

取新鮮魚類組織臟器（肝合規意識、腦、脾有效性、腎）2g 于已洗凈創新內容、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS 混勻廣泛關註，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用善於監督。或取有可疑細胞病變的細胞懸液用于檢測就能壓製。

3.2存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應不超過 24 h更合理；-70 ℃以下可*保存，但應避免反復凍融（多凍融 3 次）更優美。

3.3運輸：采用冰或泡沫箱加冰密封進行運輸各方面。

4、一步法 RT-PCR 檢測

4.1操作方法

4.1.1樣本的處理（在樣本制備區(qū)進行）：

4.1.1.1取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管成效與經驗，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照適應性、陰性對照在試劑盒中已標出）堅實基礎，做標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板融合，無需提取核酸)

4.1.1.2每管加入 600 ?L 裂解液深入闡釋，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L相關性，一份樣本換用一個吸頭完成的事情，再加入 200 ?L 氯仿，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈穩定，以免產(chǎn)生乳化層改造層面，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min品質。

4.1.1.3取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管利用好，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預冷）， 做標記解決問題。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應的管中系列，上清液應至少吸取 500?L，不能吸出中間層相互配合，顛倒混勻慢體驗。

4.1.1.4于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置）智能化，小心倒去上清科技實力，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)建設；加入 600 ?L 75％ 乙醇在此基礎上，顛倒洗滌。

4.1.1.5于 4 ℃前來體驗、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置）自主研發，小心倒去上清，倒置于吸水紙上更加廣闊，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）損耗。

4.1.1.64 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部不斷發展，小心倒去上清積極影響，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭緊密協作，吸頭不要碰到有沉淀一面越來越重要，室溫干燥 3 min，不能過于干燥發揮重要作用，以免 RNA 不溶醒悟。

4.1.1.7加入 11 ?L DEPC 水數據顯示，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA也逐步提升，2 000 r/min 離心 5 s記得牢，冰上保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉?RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增重要的作用；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)服務好。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取核酸】反應能力。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增共謀發展；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

4.2結構重塑、試劑準備

4.2.1擴增試劑準備（在反應混合物配制區(qū)進行）：

從試劑盒中取出相應的一步法RT-PCR反應液聽得懂、RT-PCR混合酶，在室溫下融化后高質量發展，2 000 r/min 離心5 s全方位。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測總數(shù)為n，其中n為被檢樣品影響力範圍、陽性對照與陰性對照的和大局，每個樣品測試反應體系配制見下表2。

表 2 每個樣品測試反應體系配制表

試劑 RT-PCR 反應液 RT-PCR 混合酶

用量 15 μL 1.0 μL

根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量應用提升，加入到適當體積試管中主動性，充分混合均勻，向每個一步法RT-PCR管中各分裝15 μL發展的關鍵，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)道路。

4.2.2加樣（在樣本處理區(qū)進行）：

在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋緊管蓋真諦所在，500 r/min離心30s指導。

4.3、檢測（在檢測區(qū)進行）：

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內(nèi)充分，記錄樣本擺放順序進一步完善。循環(huán)條件設(shè)置如下： 一階段：42 oC/30 min；

第二階段：94 oC/4 min競爭力；

第三階段：94 oC/1 min, 55 oC/1 min調整推進，72 oC/1 min, 30個循環(huán)； 第四階段機製性梗阻，72 oC/8 min機製；

第五階段，4 oC 保存集成應用。

4.4探討、流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板不負眾望。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面明確相關要求。將10μL樣品PCR擴增產(chǎn)物和相應電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔重要意義。在電泳時設(shè)立DNA標準分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h深化涉外，當溴酚藍到達底部時停止體系。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增初預期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄服務延伸。

5共創輝煌、結(jié)果判定

5.1一步法RT-PCR后陽性對照出現(xiàn)一條320bp的DNA片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶進一步。

5.2待測樣品在相應 320 bp DNA 位置上有帶，可判陽性強大的功能。

6實際需求、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3’