真鯛虹彩病毒（RSIV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

1生產創效、試劑盒簡(jiǎn)介貨

真鯛虹彩病毒（RSIV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒主要感染當(dāng)年草魚(yú)種和青魚(yú)製高點項目，死亡率可達(dá)80%以上。其它淡水鯉科魚(yú)經過，如鰱魚(yú)簡單化、鳙魚(yú)、鯽魚(yú)明確了方向、鯉魚(yú)感染后沒(méi)有臨床癥狀系統性，但可以攜帶病毒到處傳播。該病在水溫高于20℃以上時(shí)流行, 25～28℃為流行高峰單產提升。常見(jiàn)的臨床癥狀為眼突出傳遞、體色發(fā)黑，口腔勞動精神、鰓蓋和鰭條基部出血開展攻關合作。撕開(kāi)表皮，可見(jiàn)肌肉出現(xiàn)點(diǎn)狀或塊狀出血預下達。剖檢腹腔, 可見(jiàn)腸道充血, 肝的有效手段、脾充血或因失血而發(fā)白。病原為草魚(yú)呼腸孤病毒（Grass carp reovirus方案，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員關鍵技術。病毒為直徑70nm的球形顆粒，有雙層衣殼深入，無(wú)囊膜技術研究，含有11個(gè)片段的雙鏈RNA。根據(jù)片段長(zhǎng)度大小分為大（L1開展研究、L2姿勢、L3，大小在4.0kb～3.7kb）首要任務、中（M4綠色化、M5、M6，大小在2.5～2.0kb）拓展、匈Y源配置。⊿7、S8、S9、S10優化服務策略、S11, 大小在1.6～1.0kb) 三組問題。在不同地區(qū)存在抗原性、核酸電泳圖譜、對(duì)細(xì)胞的敏感性和對(duì)魚(yú)的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經(jīng)確定的有二個(gè)典型的代表株：GCRV-873為湖南株，能在CO通過活化、CIK等細(xì)胞中大量增殖并出現(xiàn)CPE，癥狀以內(nèi)臟出血為主的特點；GCRV-9014為湖北株健康發展，能在CIK、CO細(xì)胞中大量增殖大數據，但不產(chǎn)生CPE長效機製，癥狀以肌肉出血為主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%數字技術。為了適應(yīng)草魚(yú)出血矈^戰不懈。℅CRV）快速檢測(cè)和疫病研究的需要，本公司嚴(yán)格依據(jù)SN/T3584-2013草血病檢疫技術(shù)規(guī)范規(guī)定的檢測(cè)GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)措施，在本公司嚴(yán)謹(jǐn)?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下生產(chǎn)和質(zhì)檢大大縮短。確保本試劑盒滿足標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求。本試劑盒具有快速靈敏緊密相關、特異更默契了、準(zhǔn)確、安全培訓、操作簡(jiǎn)單順滑地配合、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。

2效高、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴(kuò)增試劑。具體組成參見(jiàn)表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

*： 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應(yīng)液

酶混合物陰性對(duì)照

GCRV-9014 陽(yáng)性對(duì)照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

（注：*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）

3基礎、樣本采集,存放及運(yùn)輸

3.1真鯛虹彩病毒（RSIV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干性能。

取新鮮魚(yú)類組織臟器（肝、腦對外開放、脾技術創新、腎）2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨探索創新，加 5ml PBS 混勻帶來全新智能，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中備用實現了超越。或取有可疑細(xì)胞病變的細(xì)胞懸液用于檢測(cè)去完善。

3.2存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h橋梁作用；-70 ℃以下可*保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融 3 次）求索。

3.3運(yùn)輸：采用冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸讓人糾結。

4、一步法 RT-PCR 檢測(cè)

4.1操作方法

4.1.1樣本的處理（在樣本制備區(qū)進(jìn)行）：

4.1.1.1取 n 個(gè)滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管穩定發展，其中 n 為被檢樣品與陰性對(duì)照的和（陽(yáng)性對(duì)照基石之一、陰性對(duì)照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記增持能力。(注：試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照直接作為 PCR 檢測(cè)的模板共同努力，無(wú)需提取核酸)

4.1.1.2每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對(duì)照各 200 ?L追求卓越，一份樣本換用一個(gè)吸頭逐漸完善，再加入 200 ?L 氯仿，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過(guò)于強(qiáng)烈覆蓋，以免產(chǎn)生乳化層異常狀況，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min高效。

4.1.1.3取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管應用創新，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預(yù)冷）， 做標(biāo)記機構。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中的特性，上清液應(yīng)至少吸取 500?L，不能吸出中間層基礎，顛倒混勻提供堅實支撐。

4.1.1.4于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）高產，小心倒去上清信息化技術，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)良好；加入 600 ?L 75％ 乙醇創新的技術，顛倒洗滌。

4.1.1.5于 4 ℃顯著、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）快速增長，小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）高質量。

4.1.1.64 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）提供了有力支撐，將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清前景，用微量加樣器將其吸干進一步意見，一份樣本換用一個(gè)吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面大大提高，室溫干燥 3 min的必然要求，不能過(guò)于干燥，以免 RNA 不溶取得了一定進展。

4.1.1.7加入 11 ?L DEPC 水完善好，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA積極參與，2 000 r/min 離心 5 s問題分析，冰上保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉?RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增交流研討；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)更加完善。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說(shuō)明書(shū)》（貨號(hào)：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取核酸】建設應用。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增支撐作用；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

4.2動力、試劑準(zhǔn)備

4.2.1真鯛虹彩病毒（RSIV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：

從試劑盒中取出相應(yīng)的一步法RT-PCR反應(yīng)液同時、RT-PCR混合酶，在室溫下融化后效高性，2 000 r/min 離心5 s模式。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測(cè)總數(shù)為n，其中n為被檢樣品提升、陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的和高品質，每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)下表2。

表 2 每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制表

試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 RT-PCR 混合酶

用量 15 μL 1.0 μL

根據(jù)測(cè)試樣品的數(shù)量計(jì)算好各試劑的使用量意料之外，加入到適當(dāng)體積試管中文化價值，充分混合均勻，向每個(gè)一步法RT-PCR管中各分裝15 μL置之不顧，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)非常重要。

4.2.2加樣（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）：

在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋緊管蓋空間廣闊，500 r/min離心30s。

4.3、檢測(cè)（在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行）：

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測(cè)儀內(nèi)知識和技能，記錄樣本擺放順序取得顯著成效。循環(huán)條件設(shè)置如下： 一階段：42 oC/30 min；

第二階段：94 oC/4 min實現；

第三階段：94 oC/1 min, 55 oC/1 min不容忽視，72 oC/1 min, 30個(gè)循環(huán)； 第四階段服務體系，72 oC/8 min說服力；

第五階段，4 oC 保存分析。

4.4表示、瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽非常激烈，使電泳緩沖液剛好淹沒(méi)膠面競爭力所在。將10μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和相應(yīng)電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對(duì)照領域。5 V/cm電泳約0.5 h溝通機製，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增初預(yù)期的特異性DNA電泳帶註入新的動力，拍攝并記錄領先水平。

5、真鯛虹彩病毒（RSIV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒結(jié)果判定

5.1一步法RT-PCR后陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條320bp的DNA片段雙重提升。陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有該核酸帶戰略布局。

5.2待測(cè)樣品在相應(yīng) 320 bp DNA 位置上有帶，可判陽(yáng)性求索。

6讓人糾結、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3’