萊氏無膽甾原體PCR 檢測試劑盒說明書

1、 試劑盒簡介

 流行性造血器官壞死病凝聚力量，是由無囊膜胞漿型虹彩病毒科蛙病毒屬的流行性造血器官壞死病毒

（EHNV）所引起的魚類疾病。病魚因肝臟聽得進、脾臟新的力量、腎臟造血組織和其他組織壞死而導(dǎo)致死亡。易感動(dòng)物主要為赤鱸便利性、虹鱒等種類全面展示，其中，赤鱸對該病毒極為敏感深刻認識，幼魚和成魚都可受 EHNV 感染核心技術。EHNV 屬于虹彩病毒科蛙病毒屬（除新加坡石斑魚虹彩病毒之外）病毒，本公司針對蛙病毒屬的流行性造血器官壞死病毒( epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV)等病毒的主衣殼蛋白( MCP) 基因序列主動性，開發(fā)生產(chǎn)了本試劑盒創造性。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測具有快速、靈敏道路、特異規模設備、準(zhǔn)確 、安全指導、操作簡單競爭力、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。

2進一步完善、萊氏無膽甾原體PCR 檢測試劑盒 試劑盒組成

試劑盒組成包括*和核酸擴(kuò)增試劑集聚，具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

*： 樣品 DNA 提取液 1

樣品 DNA 提取液 2 5ml×1 管

500µl×1 管

核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水

EHNV 熒光 PCR 反應(yīng)液

Taq 酶(5U/ul) 陰性對照

EHNV 熒光陽性對照 5ml×1 管

750µl×1 管

40µl×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存調整推進。

3發展基礎、 樣本采集，存放及運(yùn)輸

樣本采集

采集活的或?yàn)l死的魚的腎或脾等組織建強保護，研磨PBS稀釋后提取核酸∩a效率；?qū)⒓?xì)胞培養(yǎng)分離病毒的有CPE 的細(xì)胞懸液提取核酸病毒使命責任。

存放

研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；-70 ℃以下可*保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融 3 次）合規意識。

運(yùn)輸

采用冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸密度增加。

4、 萊氏無膽甾原體PCR 檢測試劑盒 檢測步驟

DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)：

取 n 個(gè) 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管創新內容，其中 n 為待檢樣品數(shù)構建、一管陽性對照和一管陰性對照之和， 對每個(gè)管進(jìn)行編號標(biāo)記服務延伸。

每管加入 100 µl DNA 提取液 1共創輝煌，然后分別加入待測樣本、陰性對照和陽性對照(陽性對照吸取前充分混勻)各 100µl進一步，一份樣本換用一個(gè)吸頭大部分；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下， 12 000 r/min 離心 10 min實際需求。

盡可能吸棄上清且不碰沉淀解決方案，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃ 條件下善謀新篇，2 000 r/min 離心 10 s增產。

100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水方法，12 000 r/min 離心 10 min行動力，吸取上清， 即為提取的 DNA穩中求進，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）統籌。

熒光 PCR 檢測

擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：

從試劑盒中取出熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶協同控製，2000×g 離心 5 秒鐘振奮起來。每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制見下表 2。

表 2 每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制表

試劑 熒光 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計(jì)

用量 14.5 μL 0.5μL 15μL

加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：

向每個(gè)PCR 管中各分裝15μL 的混合液利用好，再分別加入樣本DNA 模板10μL深入各系統，蓋緊管蓋，500 r/min

離心 30 s系列。

熒光 PCR 檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）： 循環(huán)條件設(shè)置：

一階段作用，94 oC /4 min；

萊氏無膽甾原體PCR 檢測試劑盒 第二階段慢體驗，95oC/15 s著力增加，60 oC/60 s； 40個(gè)循環(huán)科技實力；在每次循環(huán)的60 oC退火延伸時(shí)收集熒光處理。試驗(yàn)檢測結(jié)束后建設，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。

5開展研究、 結(jié)果判定

結(jié)果分析條件設(shè)定

直接讀取檢測結(jié)果姿勢。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的點(diǎn)為準(zhǔn)首要任務。

質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

5.2.1陰性對照無Ct值或無擴(kuò)增曲線綠色化。

5.2.2陽性對照的Ct值應(yīng)<28.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線發展。否則保持穩定，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。

結(jié)果描述及判定

5.3.1陰性

無Ct值或無擴(kuò)增曲線宣講活動，示樣品中無EHNV核酸不斷進步。

5.3.2陽性

Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線效率，示樣品中存在EHNV核酸規模。為進(jìn)一步確診是EHNV，建議用普通PCR進(jìn)行確認(rèn)或測序講道理。

5.4 有效原則

Ct>30的樣本建議重做發展目標奮鬥。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性更多的合作機會。

6延伸、 相關(guān)技術(shù)信息

MCP-153F: 5’-TCACCAAGCTGCCGTCTCT-3’ MCP-215R:5’-AAAACTGCTGCCCGAAAGC-3’

MCP-175T: (FAM)5’-CGCCAAGATGTCGGGCAACCC-3’(TAMR