不動桿菌屬通用PCR 檢測試劑盒說明書

1形式、試劑盒簡介貨

不動桿菌屬通用PCR 檢測試劑盒主要感染當(dāng)年草魚種和青魚共創美好，死亡率可達80%以上推動並實現。其它淡水鯉科魚，如鰱魚覆蓋範圍、鳙魚信息化、鯽魚、鯉魚感染后沒有臨床癥狀實踐者，但可以攜帶病毒到處傳播取得明顯成效。該病在水溫高于20℃以上時流行, 25～28℃為流行高峰。常見的臨床癥狀為眼突出數據、體色發(fā)黑創新的技術，口腔、鰓蓋和鰭條基部出血顯著。撕開表皮快速增長，可見肌肉出現(xiàn)點狀或塊狀出血。剖檢腹腔, 可見腸道充血, 肝占、脾充血或因失血而發(fā)白高質量。病原為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus提供了有力支撐，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員。病毒為直徑70nm的球形顆粒前景，有雙層衣殼實事求是，無囊膜，含有11個片段的雙鏈RNA落到實處。根據(jù)片段長度大小分為大（L1服務水平、L2、L3技術創新，大小在4.0kb～3.7kb）處理方法、中（M4、M5持續向好、M6習慣，大小在2.5～2.0kb）、羞M展情況。⊿7導向作用、S8、S9應用的選擇、S10十大行動、S11, 大小在1.6～1.0kb) 三組。在不同地區(qū)存在抗原性背景下、核酸電泳圖譜綜合措施、對細胞的敏感性和對魚的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經(jīng)確定的有二個典型的代表株：GCRV-873為湖南株自然條件，能在CO設計標準、CIK等細胞中大量增殖并出現(xiàn)CPE，癥狀以內(nèi)臟出血為主互動互補；GCRV-9014為湖北株發揮重要帶動作用，能在CIK、CO細胞中大量增殖意料之外，但不產(chǎn)生CPE文化價值，癥狀以肌肉出血為主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%置之不顧。為了適應(yīng)草魚出血膊粩嗤晟?。℅CRV）快速檢測和疫病研究的需要，本公司嚴格依據(jù)SN/T3584-2013草魚出血病檢疫技術(shù)規(guī)范規(guī)定的檢測GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)方便，在本公司嚴謹?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下生產(chǎn)和質(zhì)檢基礎上。確保本試劑盒滿足標(biāo)準(zhǔn)的檢測要求。本試劑盒具有快速靈敏應用領域、特異融合、準(zhǔn)確深入闡釋、安全、操作簡單完成的事情、應(yīng)用廣泛等特點及優(yōu)點物聯與互聯。

2、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴增試劑進入當下。具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

*： 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴增試劑： DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應(yīng)液

酶混合物陰性對照

GCRV-9014 陽性對照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

（注：*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）

3、樣本采集,存放及運輸

4效高化、樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干新體系。

取新鮮魚類組織臟器（肝、腦創造、脾不難發現、腎）2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨設備製造，加 5ml PBS 混勻發展需要，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用」芾?；蛉∮锌梢杉毎∽兊募毎麘乙河糜跈z測顯示。

存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；-70 ℃以下可*保存效率和安，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融 3 次）設計能力。

運輸：采用冰hu或泡沫箱加冰密封進行運輸。

4深入開展、一步法 RT-PCR 檢測

不動桿菌屬通用PCR 檢測試劑盒操作方法

樣本的處理（在樣本制備區(qū)進行）：

取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管更為一致，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出）技術的開發，做標(biāo)記研究與應用。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)

每管加入 600 ?L 裂解液更高效，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L全面協議，一份樣本換用一個吸頭，再加入 200 ?L 氯仿具體而言，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈新的動力，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻）發展契機，于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min像一棵樹。

取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預(yù)冷）去突破， 做標(biāo)記能運用。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中達到，上清液應(yīng)至少吸取 500?L，不能吸出中間層不可缺少，顛倒混勻蓬勃發展。

于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置）積極回應，小心倒去上清重要性，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)多種場景；加入 600 ?L 75％ 乙醇多元化服務體系，顛倒洗滌。

于 4 ℃擴大公共數據、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置）深度，小心倒去上清，倒置于吸水紙上核心技術體系，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）開拓創新。

4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部必然趨勢，小心倒去上清促進善治，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭多樣性，吸頭不要碰到有沉淀一面實事求是，室溫干燥 3 min，不能過于干燥落到實處，以免 RNA 不溶服務水平。

加入 11 ?L DEPC 水，輕輕混勻技術創新，溶解管壁上的 RNA處理方法，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)溆贸掷m向好。提取?RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增習慣；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用兩個角度入手，更方便快捷提取核酸】建強保護。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)生產效率。

使命責任、試劑準(zhǔn)備擴增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行）：從試劑盒中取出相應(yīng)的一步法RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR混合酶使用，在室溫下融化后合規意識，2 000 r/min 離心5 s密度增加。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測總數(shù)為n，其中n為被檢樣品創新內容、陽性對照與陰性對照的和機遇與挑戰，每個樣品測試反應(yīng)體系配制見下表2。

表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表

試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 RT-PCR 混合酶

用量 15 μL 1.0 μL

根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量善於監督，加入到適當(dāng)體積試管中集成技術，充分混合均勻，向每個一步法RT-PCR管中各分裝15 μL更合理，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)適應能力。

加樣（在樣本處理區(qū)進行）：

在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋緊管蓋有所應，500 r/min離心30s足了準備。

檢測（在檢測區(qū)進行）：

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內(nèi)合作關系，記錄樣本擺放順序著力提升。循環(huán)條件設(shè)置如下： 第yi 階段：42 oC/30 min；

第二階段：94 oC/4 min傳遞；

第三階段：94 oC/1 min, 55 oC/1 min融合，72 oC/1 min, 30個循環(huán)； 第四階段相關性，72 oC/8 min完成的事情；

第五階段，4 oC 保存穩定。

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板改造層面。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面優勢與挑戰。將10μL樣品PCR擴增產(chǎn)物和相應(yīng)電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔經驗分享。在電泳時設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h解決問題，當(dāng)溴酚藍到達底部時停止系列。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增初預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄相互配合。

5慢體驗、不動桿菌屬通用PCR 檢測試劑盒結(jié)果判定

一步法RT-PCR后陽性對照出現(xiàn)一條320bp的DNA片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶智能化。

待測樣品在相應(yīng) 320 bp DNA 位置上有帶科技實力，可判陽性。

6建設、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3