水質(zhì)  蛔蟲卵的測定  沉淀集卵法

蛔蟲卵測定適用范圍：

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中蛔蟲卵的沉淀集卵法全會精神。 

本校準(zhǔn)適用于地表水和廢水中的蛔蟲卵測定系統穩定性。

當(dāng)取樣體積為10L時(shí)，本方法的檢出限為5個/10L（注：不銹鋼開口直壁容器應(yīng)選擇10L帶刻度）

規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容引用了下列文件或其中的條款集中展示。凡是不注明日期的引用文件實力增強，其有效版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

HJ/T 91地表水和污水檢測技術(shù)規(guī)范

方法原理：

沉淀集卵法主要通過樣品的濃縮探索創新、雜質(zhì)分離帶來全新智能、鏡檢計(jì)數(shù)等環(huán)節(jié)對水中的蛔蟲卵進(jìn)行測定。用60目全不銹鋼篩網(wǎng)過濾去除樣品中交大的雜質(zhì)新產品，利用蛔蟲卵比重大于水和易于沉淀的特性過夜沉淀濃縮水樣去完善，用虹吸的放大棄去上清液，用表面活性劑吐溫80作為殘液及沉淀轉(zhuǎn)移時(shí)的清洗劑長遠所需，進(jìn)一步離心濃縮轉(zhuǎn)移的剩余物求索，收集到的濃縮物用乙酸-乙酸鈉緩沖液混勻，控制溶液PH值規模，獲得親水-親脂平衡穩定發展，加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪類雜質(zhì)基石之一，使蛔蟲卵更容易下沉。再次離心濃縮樣品并棄去上部脂肪雜質(zhì)層級緩沖液層增持能力，獲得的含卵沉淀層用飽和硝酸鈉溶液混勻模樣，于計(jì)數(shù)框中靜置漂浮后鏡檢，即可測得水樣中蛔蟲卵的數(shù)量服務。

配套試劑和材料：

      分析時(shí)請使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑很重要，試驗(yàn)用水為新制備的蒸餾水或者去離子水。

一：乙酸乙酯（C4H8O2）       

二：乙酸-乙酸鈉緩沖液：PH=4.5

稱取15.0g三水合乙酸鈉(CH3COONa3H2O) ，溶于約800 ml實(shí)驗(yàn)用水中，加入3.6 ml乙酸(CH;COOH)調(diào)節(jié)pH值至4.5有很大提升空間， 用實(shí)驗(yàn)用水定容至1000 ml。此溶液保質(zhì)期為30d應用創新。

三：吐溫80溶液: q (C24H4O6) =1 %o。

      移取1ml吐溫80(Tween80)機構，用實(shí)驗(yàn)用水稀釋定容至1000ml,臨用現(xiàn)配的特性。

四：飽和硝酸鈉(NaNO3) 溶液

      稱取略多于實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度對應(yīng)溶解度的硝酸鈉(NaNO3),充分溶解于100g實(shí)驗(yàn)用水中，用濾紙濾去殘?jiān)鼌f調機製，臨用現(xiàn)配信息化。硝酸鈉在不同溫度下的溶解度見附錄A。

配套儀器和耗材：

      分析時(shí)如有量器請使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的A級量器

一：顯微鏡：物鏡4x實踐者、10倍取得明顯成效，目鏡10x倍

二：冰箱：0℃-4℃

三：水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)：帶50ml螺口尖底離心管，離心力1000g以上

四：漩渦混合器

五：篩網(wǎng)：60目 數據，孔徑250um 

六：不銹鋼開口直壁容器10L（帶刻度

七：開口直壁量筒：1000ml   A級

八：虹吸管

九：洗瓶

十：螺口尖底離心管50ml

十一：一次性巴氏滴管3ml創新的技術、10ml

十二：微移液器：1000ul

十三：定量計(jì)數(shù)框：1ml網(wǎng)格、5ml型

樣品：

按HJ/T 91中對一般污染物采樣的要求顯著，用10 L以上容積的塑料桶采樣快速增長。采樣前需用樣品蕩洗塑料桶，采集樣品量應(yīng)≥10L,常溫下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室占，立即進(jìn)行過濾(7.1)和沉淀(7.2)高質量。

分析步驟：

一：過濾

      充分搖勻樣品，轉(zhuǎn)入不銹鋼開口直壁容器至10L刻度動手能力。如樣品中含有草梗逐步改善、紙?jiān)容^大雜質(zhì)意見征詢，需將樣品用篩網(wǎng)過濾提升，并用吐溫80溶液清洗篩網(wǎng)及雜質(zhì)，洗液并入過濾后的10L樣品中的必然要求。

二：沉淀

      上述樣品在15 C~25 C室溫下靜置過夜沉淀12 h~24 h,用虹吸管小心吸取并棄去上清液研究成果，避免擾動取得了一定進展，保留1 L含沉淀物的樣品，轉(zhuǎn)入1000 ml開口直壁量筒大面積，分別用50 ml吐溫80溶液*清洗不銹鋼開口直壁容器3次積極參與，洗液并入開口直壁量筒。在15 C~25 C室溫下再次靜置過夜沉淀12h~24h,用虹吸管吸取并棄去上清液培養，避免擾動交流研討，保留90 ml~ 100 ml含沉淀物的樣品。

      注1:若樣品中蛔蟲卵濃度在10倍檢出限以上(>50個/10L),采樣時(shí)形式，可只采總量不小于1L的樣品建設應用，取1L水樣直接進(jìn)行第二步的量筒沉淀濃縮。當(dāng)樣品中含有草梗日漸深入、紙?jiān)容^大雜質(zhì)動力，同樣應(yīng)先將樣品用篩網(wǎng)過濾，并用吐溫80溶液清洗篩網(wǎng)及雜質(zhì)可靠保障，洗液并入1 L樣品中沉淀自然條件。

離心：

沉淀濃縮后的樣品(7.2) 小心轉(zhuǎn)移至3個螺口尖底離心管，分別用15 ml 吐溫80溶液*清洗開口直壁量筒3次開展，洗液均勻并入3個螺口尖底離心管互動互補。以1000g 的離心力(離心機(jī)轉(zhuǎn)速計(jì)算見附錄A)離心15 min,用巴氏滴管小心吸取并棄去，上清液意向，少量留之成就，避免帶出沉淀。

      用少量吐溫80溶液將3個離心管中的沉淀進(jìn)行懸浮開展面對面，將沉淀量少的2個離心管中的懸浮液并入沉淀量多的一個離心管中:分別用3 ml~ 5 ml吐溫80溶液*清洗被轉(zhuǎn)移懸浮液的2個離心管系統，每支清洗3次，確保沒有沉淀被丟棄進一步提升，洗液并入沉淀量多的離心管空間廣闊。以1000g的離心力離心15min, 用巴氏滴管小心吸取并棄去上清液，少量留之改革創新，避免帶出沉淀知識和技能。

脂類雜質(zhì)分離去除：

用與離心后沉淀等體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液對沉淀進(jìn)行懸浮(即:離心后沉淀體積為2 ml,加入2ml緩沖液。如果離心后沉淀體積不足2ml,加入緩沖液至4 ml新模式。以確保用乙酸乙酯浸提后實現，沉淀上方有足夠體積的緩沖液，便于脂類雜質(zhì)層*傾出組織了，且避免蛔蟲卵沉淀層的丟失服務體系。

      加入2倍離心后沉淀體積的乙酸乙酯，用渦旋混勻器*混合搶抓機遇。以.1000g的離心力離心15 min分析， 樣品被分為清晰的三層表示。所有的非脂肪物質(zhì)、重碎片非常激烈，包括蛔蟲卵競爭力所在、幼蟲和原生動物在底層;中間層是緩沖液層;脂肪和其他脂溶性物質(zhì)在上方形成黑而厚的一層。

      將上層和中間層液體平穩(wěn)傾出棄去領域，記錄底層沉淀體積溝通機製。如有必要，可用細(xì)針在離心管壁四周對上層的脂肪層進(jìn)行松動管理。

鏡檢：

加入5倍底層沉淀(7.4)體積的飽和硝酸鈉溶液方式之一，對分離去除脂類雜質(zhì)后的含卵底層沉淀進(jìn)行懸浮。該懸浮液可置于0 C~4 C冰箱冷藏保存新型儲能，備檢創新能力，于1周內(nèi)檢測完畢，檢測時(shí)需將其靜置至室溫範圍。充分搖勻懸浮液求得平衡，將其轉(zhuǎn)入定量計(jì)數(shù)框靜置5 min,在顯微鏡下計(jì)數(shù)，直至全部懸浮液鏡檢完成空間廣闊。分別用1 ml飽和硝酸鈉溶液充分洗滌鏡檢完的離心管3次至關重要，將洗液轉(zhuǎn)入定量計(jì)數(shù)框，按以上步驟鏡檢服務品質。所有檢測到的蛔蟲卵全部計(jì)數(shù)的發生。

      鏡檢時(shí)，需保持環(huán)境條件的穩(wěn)定影響，無震動和風(fēng)擾新的動力，緩移計(jì)數(shù)框，自上而下“U”型逐列計(jì)數(shù)發展契機V泛關註；紫x卵鑒定方法見附錄B。

空白對照試驗(yàn)：

取10L同批次試驗(yàn)用水發力，按以上采樣及分析步驟進(jìn)行全程序樣品的測定優勢領先。

結(jié)果計(jì)算于表示：

計(jì)算結(jié)果：

C------水樣中蛔蟲卵濃度（個/10L）

N-----檢測到的所有蛔蟲卵數(shù)（個）

Q-----實(shí)際水樣體積（10L）

結(jié)果表示：

      水質(zhì)中蛔蟲卵的測定，實(shí)驗(yàn)終結(jié)果取整數(shù)共創美好，以“個/10L”為單位

精密度：

6家實(shí)驗(yàn)室分別對實(shí)際樣品和低濃度(20 個/10L)推動並實現、中濃度(40 個/10L)、高濃度(80個/10L)自配樣品的蛔蟲卵進(jìn)行測定覆蓋範圍，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為:6.5%~18.9%優化程度，10.1%~22.0%，12.8%~23.8%， 8.9%~ 17.4%;實(shí)驗(yàn)室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.8%取得明顯成效、5. 5%約定管轄、4.9%數據、4.8%; 重復(fù)性限(個/10L)為244創新的技術、3、7發行速度、11;再現(xiàn)性限(個/10L)為260更加堅強、3、7性能、11初步建立。

質(zhì)量保證和質(zhì)量控制：

      每批次樣品至少做1個全程序空白實(shí)驗(yàn)，并取10%的樣品進(jìn)行平行樣測定供給，全程序空白實(shí)驗(yàn)不得檢出蛔蟲卵的方法，平行樣間的相對偏差不得超過30%。

廢物處理：

      實(shí)驗(yàn)中虹吸液煮沸10min后可按普通廢棄物處理進行探討，含乙酸乙酯的廢棄液應(yīng)集中保管落到實處，委托有資質(zhì)的單位進(jìn)行處理。

注意事項(xiàng)：

實(shí)驗(yàn)用過的器具均需進(jìn)行高溫滅活最新，置于水中煮沸10min后方可再次使用技術創新。

      實(shí)驗(yàn)操作人員要注意自身防護(hù)，試驗(yàn)時(shí)要穿戴工作服重要作用、乳膠手套持續向好、及等，同時(shí)還要避免蛔蟲卵的樣品污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境充足。

附錄A

硝酸鈉水中溶解度進展情況、離心機(jī)離心力及轉(zhuǎn)速計(jì)算公式

A.1  硝酸鈉在水中的溶解度

表A.1   硝酸鈉水中溶解度

A.2離心力計(jì)算公式：

附錄B

蛔蟲卵的檢定

B.1蛔蟲卵的形態(tài)特征

B.1.1受精蛔蟲卵

      蟲卵呈短橢圓形，大小為45 μm~75 μmx35 μm~ 50 μm綠色化發展。卵殼很厚應用的選擇，自外向內(nèi)分為三層:受精膜、殼質(zhì)層和蛔甙層左右，殼質(zhì)層較厚背景下，另兩層極薄，在普通顯微鏡下難以分清可靠保障。卵殼內(nèi)有一個大而圓未分裂的受精卵細(xì)胞自然條件，與卵殼間常見有新月形空隙。卵殼外有一層由蟲體子宮分泌形成的蛋白質(zhì)膜開展，其表面凹凸不平呈波浪狀互動互補。隨糞便排出的蟲卵常被膽汁染成黃色或棕褐色。

B.1.2未受精蛔蟲卵

      蟲卵呈長橢圓形或不規(guī)則形，大小為88 μm~94 μmx39 μm ~44 μm意料之外，卵殼與蛋自質(zhì)膜均較受精蛔蟲卵薄至關重要，淡黃色，無蛔甙層效果，卵殼內(nèi)含有許多大小不一的屈光顆粒有所應。

B.1.3感染期蛔蟲卵

      卵內(nèi)含有一.條卷曲的幼蟲。

B.1.4蛋白質(zhì)膜脫落的蛔蟲卵

      若蛔蟲卵的蛋白質(zhì)膜脫落合作關系，卵殼則呈無色透明著力提升，應(yīng)注意與其他線蟲卵的鑒別。

B.2蛔蟲卵參考圖片

B.2.1蛔蟲卵模式圖

B.2.2發(fā)育各階段的蛔蟲卵

附錄C

蛔蟲卵配置樣品的制備

豬蛔蟲(Ascaris suum)活成蟲采集自屠宰場傳遞，用蒸餾水洗滌干凈后融合，放置于含4 %*內(nèi)，0 C~4 C保存?zhèn)溆孟嚓P性，可長期保存完成的事情。

      制備蛔蟲卵備用液時(shí)，選取2~3條雌性蛔蟲穩定，用75 %乙醇消毒過的*改造層面，劃開蟲體，每條蛔蟲一- 對子宮選取靠近陰門的一段(2 mm~3 mm),解剖后效高化，將含蛔蟲卵的內(nèi)容物及組織碎片放入50ml離心管中新體系，加入數(shù)顆直徑1mm玻璃珠及10ml生理鹽水，混勻后于渦旋混勻器振蕩3min~5min,用260目網(wǎng)過篩創造，取40ml生理鹽水分?jǐn)?shù)次沖洗離心管和篩網(wǎng)不難發現，此時(shí)獲得的濾液中蛔蟲卵呈單個狀態(tài)存在。濾液加入甲醛至終濃度為4%設備製造，0 C~4 C保存?zhèn)溆冒l展需要，可保?/span>1個月。即制即用時(shí)可不添加甲醛管理。

      制備配制樣品時(shí)顯示，搖勻蛔蟲卵備用液，用1000 μ1微量移液器效率和安，立即吸取適量的蛔蟲卵備用液于1ml定量計(jì)數(shù)框(網(wǎng)格)中設計能力，計(jì)數(shù)后用250μl微量移液器向計(jì)數(shù)框中添加或移出蛔蟲卵至所需數(shù)量。將計(jì)數(shù)框中所有的液體用吐溫80溶液沖洗入配制樣品中深入開展。再在顯微鏡下檢測計(jì)數(shù)框更為一致，確保無蛔蟲卵殘留。