流式實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中奮勇向前，除了常見的表面抗原染色，還會進(jìn)行胞內(nèi)因子檢測約定管轄，比如：常見的細(xì)胞因子：IFN數據、IL-2、IL-4發揮、IL-6顯著、IL-10、TNF開放以來；核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子：FOXP3占、GATA3、STAT5提供了有力支撐；胞內(nèi)信號通路相關(guān)蛋白：MAPK家族 (AKT供給、P38、JNK實事求是、ERK) 等進行探討。胞內(nèi)染色步驟相對復(fù)雜，涉及的變異因素多服務水平，很容易出現(xiàn)結(jié)果不穩(wěn)定最新、較難重復(fù)等問題。
 

　　一般情況下處理方法，靜息狀態(tài)的T重要作用、B細(xì)胞不產(chǎn)生或極低產(chǎn)生細(xì)胞因子，多數(shù)細(xì)胞因子必須在T細(xì)胞激活后才能分泌產(chǎn)生習慣，所以必須采用體外激活來刺激細(xì)胞因子的表達(dá)充足。流式胞內(nèi)染色中*常用的活化方法就是使用一定濃度的廣泛性刺激劑：PMA (佛波酯) 和lonomycin (離子霉素)，刺激細(xì)胞4-6 h (可優(yōu)化)的積極性。
 

　　PMA和lonomycin刺激細(xì)胞活化的機(jī)制：在細(xì)胞內(nèi)綠色化發展，Protein kinase C(PKC) 的激活至關重要，可以引起下游眾多蛋白激酶的磷酸化，形成級聯(lián)反應(yīng)用上了，導(dǎo)致多種蛋白的表達(dá)引起細(xì)胞的活化背景下。PKC可以在DAG (二酯酰甘油) 和Calcium (Ca2+) 的共同作用下被激活，PMA是一種DAG的模擬物可靠保障，lonomycin 是Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)劑，可將細(xì)胞器內(nèi)的Ca2+ 轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿設計標準，所以PMA和lonomycin的共同作用可以激活PKC開展，從而引起一系列的下游反應(yīng)。
 

　　刺激后的細(xì)胞不能直接進(jìn)行流式檢測發揮重要帶動作用，細(xì)胞因子會分泌到胞外影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果意向，還需要加入阻斷劑，將細(xì)胞因子阻斷在胞內(nèi)文化價值，有助于細(xì)胞因子的聚集使胞內(nèi)染色信號增強(qiáng)形式，提高檢出率，所以這一步至關(guān)重要不斷完善。常用的阻斷劑有兩種：1. Monensin (莫能霉素)數字化；2. Brefeldin A (BFA，布雷非德菌素a)著力提升。
 

　　Monensin是一種離子載體(ionophore)深刻內涵，可選擇性結(jié)合單價(jià)陽離子如：Li+、Na+融合、K+深入闡釋、Rb+、Ag+和Tl+完成的事情，并把這些陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜內(nèi)物聯與互聯，破壞跨膜離子梯度；BFA是一種真菌代謝物改造層面，可以干擾囊泡自粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)供給。這兩種阻斷劑的區(qū)別：Monensin的阻斷作用在高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，BFA的阻斷作用在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體新體系。