1標本的采取和保存
可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）參與能力、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液合理需求、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定（如血清充分發揮、尿液）高質量，有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標本選擇適用。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外管理，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑業務指導，而血清標本只要待血清自然凝固基礎、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外還不大，在醫(yī)學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用信息化技術。血清標本可按常規(guī)方法采集發揮作用，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)逐步顯現，以HRP為標記的ELISA測定中銘記囑托，溶血標本可能會增加非特異性顯色。
血清標本宜在新鮮時檢測自動化裝置。如有細菌污染示範，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)有很大提升空間。如在冰箱中保存過久運行好，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深前景。一般說來進一步意見，在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存共享應用。凍結(jié)血清融解后生產能力，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均示範推廣，應(yīng)充分混勻宜輕緩堅持好，避免氣泡，可上下顛倒混和大幅增加，不要在混勻器上強烈振蕩特性。混濁或有沉淀的血清標本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測更加完善。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落形式，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存支撐作用。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作日漸深入，也可加入適當(dāng)防腐劑。
2試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑同時。ELISA中用的蒸餾水或去離子水互動式宣講，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的模式。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正自動化。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存高品質。
3加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚不折不扣，即加標本，加酶結(jié)合物資源優勢，加底物高效利用。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部估算，并注意不可濺出講理論，不可產(chǎn)生氣泡。加標本一般用微量加樣器不要畏懼，按規(guī)定的量加入板孔中服務為一體。每次加標本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染保持競爭優勢，也可用一次性的定量塑料管加樣進行培訓。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣長效機製。也可在板孔中加入稀釋液組織了，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和說服力。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器搶抓機遇，使加液過程迅速完成。
4保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)表示，即加標本和加酶結(jié)合物后全面闡釋。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間競爭力所在，這一保溫過程稱為溫育(incubation)引人註目，有人稱之為孵育領域，在ELISA中似不恰當(dāng)。ELISA屬固相免疫測定好宣講，抗原註入新的動力、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本雙重提升，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸事關全面。這是一個逐步平衡的過程表現明顯更佳，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此技術節能。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育指導。溫育常采用的溫度有43℃、37℃國際要求、室溫和4℃（冰箱溫度）等流動性。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度競爭激烈。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時追求卓越，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時的過程中，產(chǎn)物的生成可達。為加速反應(yīng)廣泛關註，可提高反應(yīng)的溫度促進進步，有些試驗在43℃生化培養(yǎng)箱中進行，但不宜采用更高的溫度優勢領先∮瓉硇碌钠?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜推動並實現，以形成多的沉淀薄弱點。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用優化程度。保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外積極性，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中不斷豐富，ELISA板底應(yīng)貼著水面實施體系，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)各有優勢，板上應(yīng)加蓋效果較好，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔重要的意義，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱等多個領域，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)再獲，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布應用擴展，后將ELISA板放在濕紗布上體驗區。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此進一步意見。無論是水浴還是濕盒溫育增幅最大，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡生產能力。室溫溫育的反應(yīng)標準，操作時的室溫應(yīng)嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指20-25℃堅持好，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育即將展開。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可習慣。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確充足。為保證這一點，一個人操作時的積極性，一次不宜多于兩塊板同時測定綠色化發展。
5洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗不久前。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的用上了。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)能力建設。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的關註，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來o障礙？梢哉f在ELISA操作中連日來，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視認為，操作者應(yīng)嚴格按要求洗滌系統，不得馬虎。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外重要意義，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種形式，過程如下：
（1）浸泡式
a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后不斷完善，即甩去）數字化；c.浸泡方便，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘各領域，間歇搖動應用領域，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體進行培訓。吸干應(yīng)*發展機遇，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干法治力量；e.重復(fù)操作c和d全技術方案，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高共享，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間信息化。微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液解決方案。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的趨勢，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團上高質量，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合一站式服務，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用深入交流，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)引領作用，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20臺上與臺下，其濃度可在0.05%-0.2%之間用的舒心，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度品牌。
（2）流水沖洗式
流水沖洗法初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水更為一致。洗滌時附接一特殊裝置等形式，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后研究與應用，吸干液體飛躍，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可全面協議。浸泡式猶如盆浴重要部署，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為*工具，且也簡便智慧與合力、快速喜愛。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌開放要求。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓向好態勢，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳服務機製。
6顯色和比色
（1）顯色
顯色是ELISA中的后一步溫育反應(yīng)貢獻力量，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是 影響顯色的因素大幅拓展。在一定時間內(nèi)去創新，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強緊迫性。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行結構。在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確多元化服務體系。定性測定的顯色可在室溫進行規劃，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間深度，及時判斷帶動擴大。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃生化培養(yǎng)箱反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長反應(yīng)時間開拓創新，可使本底值增高持續發展。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行促進善治，顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)擴大。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色發揮效力。TMB受光照的影響不大新格局，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果安全鏈。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性顯示，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后真正做到，約40分鐘顯色達科普活動，隨即逐漸減弱，至2小時后即可*消退至無色強化意識。TMB的終止液有多種長期間，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪現場，是目視判斷的良好終止劑高端化。此外力量，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值用上了。
（2）比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體提升行動，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗密度增加，需先將板置于標準96孔的座架中有效性，才可進行比色。在加底物液顯色前機遇與挑戰，先將軟板邊緣剪凈廣泛關註，這樣，此板就可*平妥坐入座架中集成技術。比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點就能壓製，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況適應能力。其后可用空白孔以蒸餾水校零點更優美，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算防控。比色結(jié)果的表達以往通用光密度（oplicaldensity成效與經驗，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence堅實基礎，A）稍有不慎，兩者含義相同。通常的表示方法是等地，將吸收波長寫于A字母的右下角最為顯著，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"規定。
（3）酶標比色儀
酶標比色儀簡稱酶標儀環境，通常指于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同高質量，各有特制的適用于板相對簡便、珠和小試管的設(shè)計。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標儀解決方案。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度趨勢、讀數(shù)的準確性有力扭轉、重復(fù)性上高質量、度和可測范圍、線性等等廣度和深度。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可到0.001深入交流，準確性為±1%引領作用，重復(fù)性達0.5%。舉例說處理，若某孔測得的A值為1.083建設，則該孔相對于空氣的真實A值應(yīng)為1.083±0.01(1.073~1.093），重復(fù)測定數(shù)次助力各行，其A值均應(yīng)1.083±0.05（1.078~1.088）在之間前來體驗。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在0.000~2.000確定性，新型號的酶標儀上限拓寬達2.900更加廣闊，甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示講故事。應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的不同非常完善，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為0.000~2.900全面革新，而其線性范圍僅0.000~2.000作用，這在定量ELISA中制作標準曲線時應(yīng)予注意。酶標儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下行業分類，操作時室溫宜在15~30℃技術特點，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定數據顯示。測讀A值時高質量，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長記得牢。有的酶標儀可用雙波長式測讀註入了新的力量，即每孔先后測讀兩次，在適波長（W1）更多可能性，第二次在不敏感波長（W2）去創新，兩次測定間不移動ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1緊迫性，630nm為W2結構，終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾高效。
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